HIV派生的新型microRNA99對巨噬細胞TNF-α釋放的影響及其機制.pdf

1、目的：
　　探討HIV派生的新型microRNA99對巨噬細胞TNF-α釋放的影響及其機制。
　　方法：
　?。?）構建巨噬細胞模型
　　用PMA（佛波酯）刺激THP-1（人急性單核細胞白血病細胞）分化成巨噬細胞，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化。
　　（2）HIV派生的新型microRNA99對巨噬細胞TNF-α釋放的影響
　　以化學合成的物質作用于巨噬細胞，分組如下：
　　①實驗組1：

2、巨噬細胞+轉染試劑+microRNA99
　　②對照組1：巨噬細胞+轉染試劑+microRNA-TRA
　?、蹖φ战M2：巨噬細胞+LipidA
　　④對照組3：巨噬細胞+培養(yǎng)基
　　37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時收集并檢測上清液中TNF-α釋放的情況。
　?。?）HIV派生的新型microRNA99對巨噬細胞TNF-α釋放的機制研究
　?、LR8質粒轉染，實驗分組如下：
　　①實驗組

3、a：巨噬細胞+核轉液+TLR8質粒
　　②對照組b：巨噬細胞+核轉液+空質粒
　　37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后查看細胞內熒光并收集細胞。
　?、icroRNA99和LipidA分別作用于沉默后的巨噬細胞，實驗分組如下：
　　①實驗組a：巨噬細胞-TLR8質粒+microRNA99+轉染試劑
　?、趯φ战Ma：巨噬細胞-空質粒+microRNA99+轉染試劑
　　③實驗組b：巨噬細胞-TL

4、R8質粒+LipidA
　　④對照組b：巨噬細胞-空質粒+LipidA
　　37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集上清液。
　　（4）測量方法：
　?、僭诘怪蔑@微鏡下觀察THP-1細胞是否轉化為巨噬細胞；
　　②在熒光共聚焦下查看細胞內熒光判斷質粒轉染情況；
　　③采用Western Blot方法測兩組TLR8蛋白的表達水平；
　　④用ELISA試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平。

5、
　　結果:
　?。?）THP-1向巨噬細胞轉化的形態(tài)觀察
　　THP-1由圓形或類圓形，單個或葡萄串樣聚集的懸浮狀態(tài)轉化為梭形或多邊形的貼壁細胞，即巨噬細胞。
　?。?）HIV派生的新型microRNA99對巨噬細胞TNF-α釋放的影響
　　在microRNA99實驗組和LipidA對照組，上清液中TNF-α的含量明顯高于microRNA-TAR對照組和空白對照組（p<0.05），有統(tǒng)計學差異；micro

6、RNA-TAR對照組和空白對照組無明顯差異（p>0.05），無統(tǒng)計學意義；microRNA99實驗組較LipidA對照組，上清液TNF-α水平明顯升高（p<0.05），有統(tǒng)計學差異。
　?。?）HIV派生的新型microRNA99對巨噬細胞TNF-α釋放的機制研究
　　ⅰ在熒光共聚焦下查看細胞熒內光判斷質粒轉染情況
　　巨噬細胞內呈現(xiàn)綠色熒光，說明TLR8質粒及對照質粒已轉入巨噬細胞內。
　?、⒉捎肳estern

7、 Blot方法測兩組TLR8蛋白的表達水平
　　轉染TLR8質粒細胞中TLR8蛋白表達量明顯低于對照組（p<0.05），有統(tǒng)計學差異。
　?、Ｓ肊LISA試劑盒測定上清液TNF-α的水平
　　在microRNA99實驗組，上清液中TNF-α的含量明顯低于microRNA99對照組
　?。╬<0.05），有統(tǒng)計學差異；LipidA實驗組與LipidA對照組無明顯差異（p>0.05），無統(tǒng)計學意義。
　　結論: