SMG-1在正常和-或缺氧條件下與絨癌JAR細胞系凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、滋養(yǎng)細胞是母胎界面進行物質(zhì)交換的主要場所，是構(gòu)成胎盤的主要成分。在妊娠早期，胎盤氧分壓處于較低水平，妊娠8~13周時，隨著滋養(yǎng)細胞侵襲能力增強，子宮螺旋動脈發(fā)生重塑，絨毛間氧分壓增加，以此維持滋養(yǎng)細胞正常著床。若胎盤持續(xù)處于低氧狀態(tài)，滋養(yǎng)細胞的增殖、分化和凋亡等將會發(fā)生異常改變，多種妊娠期疾病，如子癇前期（PE）和胎兒生長受限（FGR）等，發(fā)生胎盤滋養(yǎng)細胞侵襲過淺，血流灌注受限，胎盤淺著床，并引發(fā)滋養(yǎng)細胞過度凋亡，嚴重影響妊娠結(jié)局。

2、r>　　生殖器形成抑制基因-1（SMG-1）屬于PI3K相關(guān)激酶（PIKK）家族，是一種絲氨酸\蘇氨酸激酶。SMG-l基因編碼含有3031個氨基酸殘基的蛋白，該蛋白包含一個保守的激酶結(jié)構(gòu)域、一個PIK相關(guān)激酶特有的C-末端結(jié)構(gòu)域以及FK506結(jié)合蛋白12-雷帕霉素復合物的結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域。最初研究者認為其參與無義介導的mRNA降解（NMD）途徑。隨著研究深入發(fā)現(xiàn)SMG-1參與細胞內(nèi)缺氧和DNA損傷等應激反應，可調(diào)控細胞增殖和凋亡等多項生理

3、功能，并對抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定潛在作用。
　　信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3（Stat3）是細胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，Stat3的C-端包含一個705位點的酪氨酸殘基（TryY705），其被酪氨酸激酶激活時，如JAK和Scr，Stat3將會沿著酪氨酸級聯(lián)反應發(fā)生磷酸化；此外，Stat3的C-端還有一個727位點的絲氨酸殘基（Ser727），由絲氨酸激酶激活，如mTOR、蛋白激酶C和CDK5，以此來最大化激活下游的轉(zhuǎn)錄基因。激活的

4、磷酸化 Stat3（p-Stat3）可調(diào)控機體細胞生理活動的基因轉(zhuǎn)錄，如細胞增殖、炎癥、侵襲和凋亡等，p-Stat3在某些病理狀態(tài)下發(fā)生異常表達，如腫瘤和子癇前期。人們還發(fā)現(xiàn)Stat3在許多缺氧細胞模型以及動物模型中參與細胞功能的調(diào)控。
　　人們常將滋養(yǎng)細胞來源的細胞系作為研究滋養(yǎng)細胞功能的細胞模型。JAR細胞來源于滋養(yǎng)細胞系，為人類絨毛膜癌的轉(zhuǎn)化細胞，是研究滋養(yǎng)細胞功能的細胞模型之一。由于胎盤原代滋養(yǎng)細胞一般取自足月產(chǎn)的胎盤或早

5、孕期的流產(chǎn)胎盤，此時滋養(yǎng)細胞數(shù)量有限，體外生長增殖能力低下，在普通培養(yǎng)基中不易貼壁生長，難以達到實驗研究需求細胞的穩(wěn)定狀態(tài)，故國內(nèi)外通常選取人絨癌系細胞來作為研究對象。
　　目的:本研究采用流式細胞術(shù)、熒光定量 PCR和蛋白印跡等方法，檢測 SMG-1在常氧條件和/或缺氧條件下對絨癌JAR細胞系凋亡水平和Stat3、p-Stat3表達水平的影響，初步探討 SMG-1在正常和/或缺氧環(huán)境中與 JAR細胞凋亡之間的關(guān)系。
　　材

6、料和方法:
　　1.研究對象:絨癌JAR細胞系（ATCC，HTB-144）購自北京鼎國昌盛生物科技公司，使用DMEM-H、10％ FBS、100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基（Genview，美國），培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。
　　2.方法:將JAR細胞接種于六孔細胞培養(yǎng)板，生長融合至70%時，在常氧條件（37℃、5%CO2，95%空氣）下和采用CoCl2建立JAR細胞缺氧條件下，進行以下分組：①

7、常氧條件分組：轉(zhuǎn)染SMG-1 siRNA組、轉(zhuǎn)染siRNA空載質(zhì)粒（陰性對照組）和空白對照組；②缺氧條件分組：正常組和缺氧處理組。采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平；采用熒光定量 PCR實驗（Real time-PCR）和免疫印跡實驗（Western Blot）檢測細胞中SMG-1、Stat3的mRNA表達水平以及SMG-1、Stat3和p-Stat3蛋白的表達水平。
　　3.統(tǒng)計學處理:用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以?

8、x±s表示，熒光定量PCR實驗結(jié)果利用2-ΔΔCT方法分析，多組數(shù)據(jù)分析時采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)分析時運用配對設(shè)計定量資料的t檢驗。以α=0.05作為檢驗標準。
　　結(jié)果:
　　1.常氧條件下SMG-1對JAR細胞凋亡率的影響:在常氧條件（37℃，5%CO2，95%空氣）下，通過瞬時轉(zhuǎn)染SMG-1的siRNA沉默SMG-1的表達后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，SMG-1的siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率為（14.69

9、±2.641）%，空白對照組為（5.43±1.043）%，陰性對照組為（7.26±1.214）%。與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計學意義，而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。即抑制SMG-1的表達后，JAR細胞凋亡水平增加。
　　2.常氧條件下SMG-1對JAR細胞Stat3 mRNA的表達影響:在常氧條件下，通過瞬時轉(zhuǎn)染SMG-1的siRNA沉默SMG-1的表達后，利用熒光定量PCR檢

10、測SMG-1和Stat3的mRNA表達水平結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組SMG-1的mRNA相對表達水平為0.430±0.040，陰性對照組的SMG-1的mRNA相對表達水平為0.949±0.047。與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組SMG-1的mRNA相對表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義；轉(zhuǎn)染組的Stat3的mRNA相對表達水平為0.667±0.069，陰性對照組為1.083±0.147，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組的Stat3的mRNA相對表達水平

11、降低，差異具有統(tǒng)計學意義。即抑制SMG-1的表達后，JAR細胞Stat3 mRNA的相對表達水平降低。
　　3.常氧條件下SMG-1對JAR細胞Stat3和p-Stat3蛋白的表達影響:在常氧條件下，通過瞬時轉(zhuǎn)染SMG-1的siRNA沉默SMG-1的表達后，利用Western Blot檢測Stat3和p-Stat3的蛋白表達水平結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組Stat3的蛋白表達水平為1.056±0.022，陰性對照組為1.872±0.036，空

12、白對照組為1.789±0.046，與陰性對照組和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組Stat3的蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義；轉(zhuǎn)染組 p-Stat3的蛋白表達水平為0.157±0.026，空白對照組為0.430±0.010，陰性對照組為0.326±0.043，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組p-Stat3的蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義。即抑制SMG-1的表達后，JAR細胞Stat3和p-Stat3的蛋白相對表達水平均降低。

13、　　4.缺氧條件下JAR細胞凋亡率的表達情況:通過 CoCl2使 JAR細胞缺氧后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平結(jié)果顯示，缺氧處理組的細胞凋亡率為（17.83±2.041）%，與對照組（4.02±1.242)%相比，缺氧處理組的細胞凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計學意義。即缺氧后JAR細胞凋亡水平增加。
　　5.缺氧條件下JAR細胞SMG-1和Stat3 mRNA的表達情況:通過CoCl2使JAR細胞缺氧后，利用熒光定量PCR檢測SMG

14、-1和Stat3的mRNA表達水平結(jié)果顯示，缺氧處理組 SMG-1的mRNA相對表達水平為3.569±0.264，與正常組相比，缺氧處理組SMG-1的mRNA相對表達水平增加，差異具有統(tǒng)計學意義；缺氧處理組 Stat3的mRNA相對表達水平為1.699±0.243，高于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義。即缺氧后JAR細胞SMG-1和Stat3的mRNA相對表達水平均增加。
　　6.缺氧條件下JAR細胞SMG-1、Stat3和p-Stat

15、3蛋白的表達情況:通過CoCl2使JAR細胞缺氧后，利用Western Blot檢測SMG-1、Stat3和p-Stat3的蛋白表達水平結(jié)果顯示，缺氧處理組SMG-1的蛋白水平為0.435±0.020，正常組為0.260±0.003，缺氧處理組與正常組相比，SMG-1的蛋白表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義；缺氧處理組 Stat3的蛋白水平為1.274±0.024，p-Stat3的蛋白水平為0.822±0.065，與正常組相比表達降低，差