GPC3基因通過Hippo-YAP調(diào)控肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究.pdf

1、目的:
　　Glypican-3(GPC3)是一種膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在肝癌組織中有特異性高表達(dá)，但GPC3對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及可能機(jī)制尚未明了。本課題主要通過轉(zhuǎn)染靶向GPC3的siRNA進(jìn)huh-7細(xì)胞中，下調(diào)GPC3表達(dá)后檢測(cè)細(xì)胞的生物學(xué)行為;探討GPC3通過與Yap的作用而參與到Hippo通路的調(diào)控中，從而影響肝癌Huh-7細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。
　　方法:
　　1.熒光定量PCR檢測(cè)GPC3基因在Be

2、l7402、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H、HepG2、Huh7、LM3肝癌細(xì)胞株及HL7702正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用siRNA設(shè)計(jì)軟件初篩6對(duì)siRNA，通過轉(zhuǎn)染肝癌Huh-7細(xì)胞后，運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)GPC3基因的表達(dá)，篩選出能有效沉默GPC3基因的siRNA。
　　3.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將GPC3-siRNA轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)然后48小時(shí)后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。
　　4.熒光定量P

3、CR和Western Blot檢測(cè)GPC3 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　5.運(yùn)用熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)沉默GPC3基因后Hippo信號(hào)通路中YAP mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　6.EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖率、Annexin V-FITC/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。
　　7.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.GPC3在肝癌

4、細(xì)胞系Bel7402、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H、HepG2、Huh7、LM3中表達(dá)分別為0、1.0、7.12、13.96、2.49、1.70E±08，其中在Huh-7細(xì)胞中表達(dá)量最高，在正常肝細(xì)胞系HL7702中不表達(dá)。
　　2.設(shè)計(jì)的6對(duì)GPC3-siRNA-1564、GPC3-siRNA-1718、GPC3-siRNA-2134、GPC3-siRNA-1633、GPC3-siRNA-647、GPC3-s

5、iRNA-714對(duì)GPC3表現(xiàn)出不同的干擾效果，其中GPC3-siRNA-1633在使用量為50nM時(shí)對(duì)GPC3基因的干擾效率最高，為74.84％。
　　3.在導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633的Huh-7細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染組、NC組中，GPC3mRNA表達(dá)量分別為1±0.22、2.41±0.1、3.69±0.39(P＜0.01)，GPC3蛋白的表達(dá)量分別為0.29±0.07、2.01±0.00、1.92±0.05(P＜0.01)，導(dǎo)入

6、GPC3-siRNA-1633后GPC3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。
　　4.導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633的Huh-7細(xì)胞的YAP mRNA的表達(dá)量為0.6±0.05，顯著低于cell組和NC組1.1±0.13，1±0.11(P＜0.01);YAP蛋白的表達(dá)量為98.91±8.61，顯著低于cell組和NC組818.59±16.22，1655.78±25.34(P＜0.01)。
　　5.轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在導(dǎo)入GPC3

7、-siRNA-1633的Huh-7細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染組、NC組中，細(xì)胞增值率分別為38.92％±1.5％、68.0％±1.8％、68.24％±1.6％(P＜0.05)，導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633后能明顯抑制Huh-7細(xì)胞的增值。
　　6.在導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633的Huh-7細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染組、NC組中，在G1期的細(xì)胞數(shù)分別為58.41±2.0％、68.12±2.4％、63.71％±2.2％(P＞0.05);在G2期的細(xì)胞

8、數(shù)分別為14.45±1.3％、12.43±1.1％、14.1±1.3％(P＞0.05);S期所占的細(xì)胞數(shù)分別為27.14±1.7％、19.45±1.5％、22.19±1.6％(P＞0.05);導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633后不影響Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　7.在導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633的Huh-7細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染組、NC組中，細(xì)胞凋亡率分別為2.89％±0.15％、2.54％±0.11％、2.04％±0.10％(P

9、＜0.05);導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633后能夠明顯誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞的凋亡。
　　8.在導(dǎo)入GPC3-siRNA-1633的Huh-7細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染組、NC組中的細(xì)胞遷移率，在54h分別為39.96±1.81、52.67±2.51、48.40±2.22;72h分別為51.94±4.28、55.12±4.36、68.95±5.12;96h分別為67.12±5.03、80.24±6.31、89.86±6.62;導(dǎo)入GPC3-si

10、RNA-1633的不同時(shí)間段遷移率明顯受到抑制。
　　9.GPC3-siRNA-1633組細(xì)胞的侵襲能力完全被抑制，與cell和NC組134.10±9.96、148.60±13.59之間差異明顯(P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.GPC3基因在7株肝癌細(xì)胞株中高表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞株中不表達(dá)，且在Huh-7細(xì)胞中的表達(dá)量最高。
　　2.GPC3-siRNA-1633在Huh-7細(xì)胞中能明顯抑制GPC3的表達(dá)。