中國西南地區(qū)原發(fā)性心肌病與線粒體基因改變的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)、肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM)是原發(fā)性心肌病中最常見的兩類，均屬于遺傳性心肌病范疇，具有明顯的遺傳學(xué)背景。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過30種基因與DCM相關(guān)，超過20種基因，1400余種突變與HCM相關(guān)。由于心臟對氧化代謝具有特殊的依賴，線粒體作為氧化磷酸系統(tǒng)(oxidativePhosphorylation，OXPHOS

2、)產(chǎn)能的關(guān)鍵，其結(jié)構(gòu)和功能改變在心臟受損中的作用越來越受到關(guān)注。迄今為止，超過300個致病線粒體基因(mt DNA)點突變被發(fā)現(xiàn)，包括蛋白編碼基因、tRNA基因、rRNA基因，并且最常見于線粒體tRNA(mt tRNA)與線粒體蛋白編碼基因cytb(mt cytb)中。由于中國對線粒體基因突變報道較少，故中國西南地區(qū)、乃至中國人群是否存線粒體基因突變或多態(tài)性，突變與多態(tài)性是否與原發(fā)性心肌病(DCM、HCM)相關(guān)，尚無足夠證據(jù)。故本實驗篩

3、選線粒體基因組中最易致變的mt cytb、mt tRNA中的Gln、Ile、Leu、Lys、Pro、Val、Ser七個基因來尋找我國DCM、HCM是否存在線粒體基因突變或多態(tài)性，并對比其是否為突變熱點或新發(fā)突變，探討線粒體基因改變在中國西南地區(qū)患者中的發(fā)病狀況，并分析其與這兩種心肌疾病發(fā)病的相關(guān)性，進而為我國西南地區(qū)漢族人群線粒體基因與原發(fā)性心肌病的遺傳相關(guān)性研究提供更多的證據(jù)及方向，并有可能為將來的基因治療提供理論依據(jù)。
　　方

4、法:研究對象選取中國西南地區(qū)的漢族人群，其中DCM患者120例，明確家系1例;HCM患者65例，明確家系2例;健康對照者200例。研究對象均行超聲心動圖、心電圖檢查，對家系繪制遺傳圖譜。研究采用病例對照研究，將mt cytb、mt tRNA Gln、mt tRNA Ile、mt tRNA Leu、mt tRNA Lys、mt tRNA Pro、mt tRNA Val、mt tRNA Ser整個基因序列作為擴增的目的序列，采用DNA試劑盒

5、從患者和健康對照者外周血中提取DNA作為擴增的模板，用primer primer5軟件設(shè)計特異性引物、聚合酶鏈擴增反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴增目的序列，擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳、Goldview染色技術(shù)、紫外線分光儀測量、凝膠成像、Sanger雙脫氧鏈終止法測定所有擴增產(chǎn)物的堿基序列，分析所得的序列圖，并將測得堿基序列同線粒體數(shù)據(jù)庫中上述基因的全基因序列進行比對，得出與DCM或HCM相關(guān)的多態(tài)(

6、SingleNucleotide Polymorphisms，SNP)或突變位點，計算SNP在患者與健康對照者間的頻率，用獨立樣本t檢驗比較患者與健康對照者之間多態(tài)位點頻率的統(tǒng)計學(xué)差異。突變點與200例健康對照者進行序列比對及分析;對臨床伴發(fā)聽力障礙的早發(fā)DCM家系直接行線粒體全基因組測序及分析。
　　結(jié)果:1.研究對象臨床特點分析:HCM患者心肌明顯增厚，多數(shù)患者伴輕度心功能不全，心電圖改變以T波改變?yōu)橹?。DCM患者全心明顯增大

7、，左心功能明顯降低，多數(shù)患者心功能為中-重度心功能不全（根據(jù)NYHA分期），心電圖改變以QRS增寬為主。2.HCM患者線粒體基因分析結(jié)果:①在mt tRNAGln基因上發(fā)現(xiàn)1個突變位點(m.4395A＞G)，發(fā)現(xiàn)于HCM家系2;HCM家系1、其余HCM患者、DCM患者及200例健康對照者中無此位點改變。此位點堿基由A突變?yōu)镚，突變位置位于mt tRNA Gln外顯子，屬于Gln的功能保守區(qū)，突變類型為點突變。此位點的突變與突尼斯一散發(fā)H

8、CM患者的發(fā)現(xiàn)一致，該突變導(dǎo)致mt tRNA Gln結(jié)構(gòu)改變，影響蛋白質(zhì)翻譯過程，為致病性突變的可能極大。②HCM家系1未發(fā)現(xiàn)上述基因突變，也未發(fā)現(xiàn)mtcytb、mt tRNA Ile、mt tRNA Leu、mt tRNA Lys、mt tRNA Pro、mt tRNAVal、mt tRNA Ser基因的突變或多態(tài)位點。③其余HCM患者均未發(fā)現(xiàn)mtcytb、mt tRNA Gln、mt tRNA Ile、mt tRNA Leu、mt

9、tRNA Lys、mt tRNAPro、mt tRNA Val、mt tRNA Ser基因的突變或多態(tài)位點。3.DCM患者基因分析結(jié)果:①通過與線粒體dbSNPC數(shù)據(jù)庫比對（線粒體參考基因組版“NC-012920.1”），在中國西南地區(qū)人群中發(fā)現(xiàn)了線粒體5個mt cytb基因多態(tài)位點，分別為: m.14766C＞G(rs527236041)、m.14783C＞T(rs527236042) m.15043G＞A(rs527236043)、

10、m.15301A＞G(rs527236045)、m.15326 A＞G(rs2853508)。mt cytb基因位于線粒體基因組第14747-15887位,整個序列均為外顯子，m.15043G＞A、m.15301A＞G、m.15326 A＞G三個位點位于其功能保守區(qū)，目前國內(nèi)外均無m.15043G＞A、m.15301A＞G兩個位點與HCM、DCM相關(guān)的報道，m.14766C＞G、m.15326 A＞G兩個位點與丹麥人群HCM多態(tài)位點一致

11、，m.15043G＞A與美國人群DCM中多態(tài)位點一致。②分別計算mt cytb基因5個多態(tài)位點在DCM患者和健康對照者中的頻率，用SPSS19對二者頻率行兩獨立樣本t檢驗，檢驗有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);并且上述多態(tài)位點在DCM患者中的頻率明顯高于健康對照者。由于線粒體遺傳遵循嚴(yán)格的母系遺傳和遺傳瓶頸作用，故其不適用于Hardy-Weinberg平衡及其檢驗，本實驗結(jié)果具有患者人群代表性。③在DCM患者mt cytb基因中發(fā)現(xiàn)5個新發(fā)

12、突變位點，分別是m.15263C＞T、m.15290C＞A、m.15330T＞G、m.15338C＞G、m.15386T＞G，并且上述位點均位于mt cytb外顯子與它的功能保守區(qū)。200例健康對照者無上述位點變化。上述突變均為單個堿基的點突變，并造成對應(yīng)氨基酸的改變，突變位點測序圖無雜帶出現(xiàn)。④DCM家系患者均伴發(fā)聽力障礙的兒童患者，本研究對此家系行線粒體全基因組測序，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在mt tRNAGlu基因上存在突變位點:m.1469

13、6A＞G，本研究所有HCM患者、其余DCM患者和200例健康對照者中均無此位點改變。此位點堿基由A突變?yōu)镚，測序結(jié)果分析得突變率為95.98％，突變類型為點突變。芬蘭人群曾報道同一突變與線粒體腦肌病相關(guān)，但此突變未發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性心肌病相關(guān)。⑤中國西南地區(qū)DCM患者未發(fā)現(xiàn)mt tRNA Gln、mt tRNA Ile、mt tRNA Leu、mt tRNALys、mt tRNA Pro、mt tRNA Val、mt tRNA Ser基因的突

14、變或多態(tài)位點。
　　結(jié)論:1.本研究對象臨床特點表明我國西南地區(qū)HCM、DCM患者以心力衰竭和心律失常為主要臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者呈散發(fā)性，部分呈家族遺傳性。2.我國西南地區(qū)漢族人群HCM與線粒體基因改變相關(guān)性分析:①在我國西南地區(qū)HCM家系患者中存在與突尼斯患者相同的線粒體基因突變位點(mttRNA Gln4395A＞G)，已證實該突變位點與HCM發(fā)病具有顯著的相關(guān)性，在中國人遺傳背景下其可能是家族性HCM(Familiar Hyp

15、ertrophicCardiomyopathy，F(xiàn)HCM)發(fā)現(xiàn)的致病基因之一。②我國西南地區(qū)漢族人群HCM可能不存在mt cytb、mt tRNA Ile、mt tRNA Leu、mt tRNA Lys、mt tRNAPro、mt tRNA Val、mt tRNA Ser基因的突變或多態(tài)性。3.我國西南地區(qū)漢族人群DCM與線粒體基因改變相關(guān)性分析:①首次在中國西南地區(qū)漢族人群DCM中發(fā)現(xiàn)了線粒體5個mt cytb基因多態(tài)位點，其中m.1

16、5043G＞A、m.15301A＞G、m.15326 A＞G為新發(fā)的多態(tài)位點，可以作為我國DCM和mt cytb多態(tài)位點分析時的一個遺傳建議;m.14766C＞G、m.15326 A＞G兩個多態(tài)位點屬HCM、DCM的共同多態(tài)位點，表明線粒體基因多態(tài)性也具有遺傳異質(zhì)性的特點。②位于mt cytb基因的五個多態(tài)位點在DCM患者中的頻率明顯高于健康對照者，說明本研究發(fā)現(xiàn)的五個多態(tài)位點與我國西南地區(qū)DCM發(fā)病存相關(guān)性。③在mt cytb基因中發(fā)

17、現(xiàn)了5個新發(fā)突變，測序圖提示突變均屬純合突變，位于保守區(qū)的這五個突變位點極大可能通過影響氧化磷酸化、呼吸鏈的形成，降低ATP生成、引起線粒體功能障礙而與DCM相關(guān)。④我國西南地區(qū)漢族人群DCM患者與mt tRNA Glu14696A＞G突變相關(guān)，該新發(fā)突變與我國DCM患者發(fā)病相關(guān)，結(jié)合芬蘭研究結(jié)果，我們推測該突變位點可能是DCM與線粒體腦肌病所共有;同時分析該突變來源的患者臨床特點，推測該突變也可能是伴發(fā)聽力障礙的早發(fā)DCM患者的致病基