Activin B通過JNK和ERK信號通路調(diào)節(jié)BMSCs促進(jìn)皮膚傷口的愈合.pdf

1、皮膚創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，它啟動一系列復(fù)雜的生物學(xué)事件，包括炎癥、組織新生及組織重構(gòu)[1]。雖然許多研究采用不同的方法治療皮膚創(chuàng)傷修復(fù)，但愈合質(zhì)量低、附屬器官不可再生等依然是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的關(guān)鍵問題。目前，皮膚移植是修復(fù)大面積皮膚損傷的最有效方法。其中，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemesenchymalstemcells，BMSCs)治療重癥皮膚創(chuàng)傷展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。已有研究結(jié)果證實(shí)BMSCs在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面起到積

2、極的作用。Badiavas將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)其明顯促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[2]。付小兵等將BMSCs移植至豬深度燒傷創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合速度明顯加快，表皮增厚，真皮神經(jīng)纖維增多，大大改善了創(chuàng)面愈合質(zhì)量[3]。文獻(xiàn)報(bào)道BMSCs還參與表皮、汗腺及創(chuàng)面血管的重建[4]。這些研究結(jié)果表明BMSCs是非常好的皮膚組織工程種子細(xì)胞。
　　 創(chuàng)傷愈合的各個(gè)階段都有生長因子的參與和調(diào)控，生長因子對治療慢性難愈合皮膚創(chuàng)口和大面積

3、燒傷創(chuàng)面有著廣闊的應(yīng)用前景[5]?；罨?Activin)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactorβ，TGFβ)超家族成員，成熟組織內(nèi)，Activin信號可調(diào)節(jié)傷口愈合和表皮再上皮化，在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中具有重要的作用[6]。而且Activin和其拮抗劑卵泡抑素(Follistatin)共同調(diào)節(jié)毛囊的發(fā)育和周期循環(huán)[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ActivinB在Invitro水平上通過JNK/MAPK信號通路促進(jìn)

4、角朊細(xì)胞的遷移，從而加速創(chuàng)傷修復(fù)過程[8，9，10];近期研究顯示:在Invivo水平上，ActvinB通過RhoA-JNK-cJun信號通路調(diào)節(jié)傷口愈合，并且在毛囊的再生和毛囊細(xì)胞的增殖方面起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[11]。
　　 干細(xì)胞從定居的部位進(jìn)入到相應(yīng)的組織器官內(nèi)才能實(shí)現(xiàn)該部位的再生和修復(fù)，而細(xì)胞遷移的過程是受趨化因子/趨化因子受體系統(tǒng)所調(diào)控的[12，13]。在創(chuàng)傷愈合的過程中，Activin/TGF-β是趨化因子之一，可以

5、通過不同的方式作用于炎癥及修復(fù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化性遷移、增殖分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌[14]。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs表面高度表達(dá)Activin受體，而且Activin/TGF-β通路下游信號分子Smad3的缺失導(dǎo)致BMSCs遷移能力降低[15,16,17]，提示Activin/TGF-β信號可能在調(diào)控BMSCs的生物學(xué)功能上發(fā)揮重要作用。因此鑒于BMSCs能加速創(chuàng)傷愈合并促進(jìn)皮膚血管及汗腺等組織的再生，而ActivinB能促進(jìn)BMSCs

6、的遷移，我們假設(shè)ActivinB可能改善了BMSCs介導(dǎo)的創(chuàng)傷修復(fù)，為了驗(yàn)證假設(shè)我們提出將ActivinB和BMSCs聯(lián)合起來，觀察其治療創(chuàng)傷愈合的作用，并在細(xì)胞水平上探索其可能的信號機(jī)制。本研究為臨床治療創(chuàng)傷修復(fù)提供了新的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、ActivinB聯(lián)合BMSCs促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合
　　 (一)目的:
　　 探討ActivinB聯(lián)合BMSCs對治療大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響。
　　 (二)

7、方法:
　　 24只健康成年SPF級SD大鼠隨機(jī)分為四個(gè)組:PBS對照組，BMSCs組，ActivinB組和ActivinB聯(lián)合BMSCs組。10％水合氯醛(0.003ml/g)腹腔注射麻醉，SD大鼠背部兩側(cè)剪毛后用蜂蜜脫毛凍蠟脫毛，制作面積為1cm2正方形切口，深達(dá)皮下。術(shù)后動物自由進(jìn)食、水。術(shù)后每天用細(xì)Mark筆將各組未愈合創(chuàng)面面積描記在透明薄膜上，利用數(shù)碼相機(jī)在相同的條件下對描記下的圖像拍照，IPP圖像分析系統(tǒng)計(jì)算未愈合創(chuàng)

8、面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合的創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100％。術(shù)后3d、7d、14d、21d取傷口周圍0.5cm皮膚，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定，PBS沖洗，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片(5μm)，二甲苯脫蠟，乙醇逐級復(fù)水，常規(guī)的蘇木精伊紅(hematoxylinandeosin，H&E)染色。
　　 (三)結(jié)果:
　　 與ActivinB、BMSCs組及PBS組相比，Acti

9、vinB聯(lián)合BMSCs組可以顯著促進(jìn)SD大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，移植后第7d、14d，ActivinB聯(lián)合BMSCs組創(chuàng)面愈合率顯著高于ActivinB、BMSCs組及PBS組。移植后第12d，ActivinB聯(lián)合BMSCs處理組的12個(gè)創(chuàng)口(n=6)已完全閉合，而ActivinB、BMSCs組及PBS組傷口尚未完全閉合。ActivinB組和BMSCs組于移植后14d創(chuàng)面完全愈合，而PBS組創(chuàng)面完全閉合發(fā)生于第16d。第14dH&E結(jié)果顯示A

10、ctivinB、BMSCs組及ActivinB聯(lián)合BMSCs處理組已經(jīng)完成再上皮化，而且與PBS組和BMSCs組相比，ActivinB組和ActivinB聯(lián)合BMSCs可以促進(jìn)皮膚毛囊的再生，提示ActivinB聯(lián)合BMSCs不但可以促進(jìn)急性創(chuàng)傷的愈合還可以促進(jìn)傷口部位毛囊的再生。
　　 (四)結(jié)論
　　 以上研究結(jié)果提示ActivinB聯(lián)合BMSCs能夠促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合。
　　 二、ActivinB對BMS

11、Cs的生物學(xué)活性的影響
　　 (一)目的
　　 在細(xì)胞(Invitro)水平及載體(Invivo)水平上探討ActivinB通過何種途徑誘導(dǎo)BMSCs從而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。
　　 (二)方法
　　 在細(xì)胞(Invitro)水平上利用免疫組化觀察K15，K19的表達(dá);利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞的Actin結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)記錄細(xì)胞遷移情況;在載體(Invivo)水平上利用Brdu標(biāo)記觀察創(chuàng)傷愈合過程中細(xì)胞增

12、殖的變化。
　　 (三)結(jié)果
　　 1.K15，K19的表達(dá):24孔板中放入coverglass，第4代BMSCs接種其中，每孔細(xì)胞含量約1×104個(gè)，分別用含5％胎牛血清的DMEM(PBS組)和5％胎牛血清+10ng/mlActivinB的DMEM(ActivinB組)培養(yǎng)。從培養(yǎng)第一天起開始直到第21d，隔天一次，取出coverglass，進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)檢測。結(jié)果顯示:PBS組和ActivinB組相比，K15，K1

13、9的表達(dá)均未見顯著性差異。
　　 2.Brdu標(biāo)記增殖細(xì)胞:進(jìn)一步利用Brdu檢測傷口周圍組織細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn):創(chuàng)傷后第7dBMSCs組、ActivinB組與ActivinB聯(lián)合BMSCs組表皮基底層部位Brdu陽性細(xì)胞數(shù)增加與PBS組相比無顯著差異。創(chuàng)傷后第14dBMSCs組、ActivinB組和ActivinB聯(lián)合BMSCs組表皮基底層部位Brdu陽性細(xì)胞數(shù)增加分別與PBS組相比有顯著差異，而BMSCs組、ActivinB組和A

14、ctivinB聯(lián)合BMSCs組表皮基底層Brdu陽性細(xì)胞數(shù)增加兩兩相比均無顯著差異。據(jù)此進(jìn)一步認(rèn)為ActivinB并非通過調(diào)節(jié)BMSCs的增殖，從而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。
　　 3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ActivinB作用30min后，肌動蛋白纖維主要分布于細(xì)胞膜附近，2h時(shí)，肌動蛋白單體重組生成大量的肌動蛋白纖維鋪滿整個(gè)細(xì)胞并持續(xù)至4h，6h后大量肌動蛋白纖維解聚僅部分存在細(xì)胞膜附近，而PBS組細(xì)胞肌動蛋白纖維數(shù)量和分布沒有變化

15、，因此認(rèn)為ActivinB調(diào)節(jié)BMSCs肌動蛋白單體的聚合。細(xì)胞肌動蛋白的聚合在細(xì)胞遷移過程中起到關(guān)鍵作用，那么ActivinB是否調(diào)節(jié)BMSCs的遷移呢？進(jìn)一步用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明，劃痕后72h，與PBS組相比，ActivinB組細(xì)胞已經(jīng)遷移至傷口，提示ActivinB促進(jìn)BMSCs向傷口部位遷移。繼而利用Transwell進(jìn)行細(xì)胞趨化遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，ActivinB組遷移至下室膜上細(xì)胞數(shù)明顯高于PBS組，表明Acti

16、vinB誘導(dǎo)趨化BMSCs的遷移。上述結(jié)果提示ActivinB通過調(diào)節(jié)肌動蛋白重組誘導(dǎo)BMSCs的趨化遷移促進(jìn)傷口愈合。
　　 (四)結(jié)論:
　　 ActivinB主要通過誘導(dǎo)BMSCs的遷移，從而起到促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。
　　 三、ActivinB誘導(dǎo)BMSCs遷移相關(guān)的MAPK信號傳導(dǎo)通路
　　 (一)目的:
　　 在細(xì)胞(Invitro)水平上探討ActivinB誘導(dǎo)BMSCs遷移的相關(guān)信號傳

17、導(dǎo)通路。
　　 (二)方法:
　　 第四代BMSCs分別經(jīng)JNK特異性抑制劑SP600125(5μmol)、p38特異性抑制劑SB202190(5μmol)、ERK特異性抑制劑SL327(5μmol)處理細(xì)胞30min后，利用Phallotoxins染色觀察ActivinB誘導(dǎo)的BMSCs骨架蛋白的變化及劃痕后細(xì)胞遷移情況。應(yīng)用WesternBlotting檢測ActivinB誘導(dǎo)的BMSCsp-JNK,p-ERK和p-

18、p38的表達(dá)。
　　 (三)結(jié)果
　　 1.Phallotoxins染色:ActivinB作用2h時(shí)，JNK特異性抑制劑SP600125和ERK特異性抑制劑SL327顯著地抑制由ActivinB誘導(dǎo)的肌動蛋白絲重組，而p38特異性抑制劑SB202190處理細(xì)胞，ActivinB刺激2h后大量的肌動蛋白重組聚合并分布整個(gè)細(xì)胞。
　　 2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:BMSCs經(jīng)特異性JNK抑制劑SP600125及特異性ERK

19、抑制劑SL327處理后發(fā)現(xiàn):ActivinB誘導(dǎo)的BMSCs遷移作用受到抑制，細(xì)胞劃痕后72h，僅經(jīng)過特異性p38抑制劑SB202190處理后的BMSCs創(chuàng)面有大量的遷移細(xì)胞，而PBS組，SP600125+ActivinB組和SL327+ActivinB組創(chuàng)面僅有較少的遷移細(xì)胞。
　　 3.WesternBlotting結(jié)果:ActivinB作用于BMSCs后10minJNK和ERK迅速磷酸化至30min達(dá)到最高水平，2h時(shí)p-

20、JNK恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，而2h時(shí)p-ERK磷酸化水平稍下降，但是p38磷酸化處于基礎(chǔ)水平。
　　 (四)結(jié)論:
　　 上述結(jié)果顯示ActivinB通過MAPK家族的JNK和ERK信號通路介導(dǎo)BMSCs肌動蛋白重組聚合和遷移。
　　 四、ActivinB聯(lián)合BMSCs不同移植途徑對大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響
　　 (一)目的:
　　 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合生長因子對治療皮膚創(chuàng)傷最為有效的移植途徑。

21、>　　 (二)方法:
　　 將18只大鼠隨機(jī)分為表皮移植組、尾靜脈移植組和實(shí)驗(yàn)對照組。大鼠均建立全層皮膚缺損模型，手術(shù)后連續(xù)三天，用含有活化素(ActivinB)(10ng/ml)的PBS重懸，繼而用綠色熒光染料CFSE標(biāo)記BMSC混懸液0.4mL，按照細(xì)胞數(shù)為1×106BMSC/天，分別通過表皮和尾靜脈移植到全層皮膚缺損模型的大鼠中，對照組移植同等劑量的生理鹽水。移植后3d、7d利用活體成像儀觀察不同途徑的移植情況，追蹤觀察

22、到14d直到全皮愈合;用冰凍切片觀察各組創(chuàng)面及不同臟器CFSE標(biāo)記BMSCs移植的情況;并于3d、7d、14d記錄大鼠皮膚創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率，不同時(shí)間點(diǎn)取組織標(biāo)本制作石蠟切片，常規(guī)HE染色觀察。
　　 (三)結(jié)果:
　　 1.活體成像儀3d、7d觀察實(shí)驗(yàn)組大鼠皮膚創(chuàng)面均有熒光顯示，而對照組創(chuàng)面處無熒光顯示。冰凍切片結(jié)果顯示CFSE標(biāo)記的BMSCs，創(chuàng)傷后第3dActivinB聯(lián)合BMSCs表皮移植組已移植入創(chuàng)面處，Ac

23、tivinB聯(lián)合BMSCs尾靜脈移植組可以觀察到向傷口遷移的趨勢。創(chuàng)傷后第7dActivinB聯(lián)合BMSCs表皮移植組傷口部位移植的BMSCs遷移至傷口邊緣參與創(chuàng)傷的愈合，ActivinB聯(lián)合BMSCs尾靜脈移植組在創(chuàng)傷邊緣再上皮化部位也可見綠色熒光，對照組無。臟器冰凍切片結(jié)果顯示:ActivinB聯(lián)合BMSCs表皮移植組和ActivinB聯(lián)合BMSCs尾靜脈移植組肺臟綠色熒光表達(dá)最強(qiáng)，腎臟也見少量綠色熒光表達(dá)而心臟、肝臟未見綠色熒光，

24、PBS組均未見綠色熒光。
　　 2.術(shù)后第7d、14dBMSCs移植組創(chuàng)面愈合率均高于對照組(P＜0.05)，而表皮移植組與尾靜脈移植組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第14dH&E結(jié)果顯示ActivinB聯(lián)合BMSCs表皮注射組及ActivinB聯(lián)合BMSCs尾靜脈注射組均已經(jīng)完成再上皮化，而且與PBS組相比，ActivinB聯(lián)合BMSCs表皮注射組及ActivinB聯(lián)合BMSCs尾靜脈注射組可以促進(jìn)皮膚毛囊的再生。
　　 (四)結(jié)