硫酸化烏賊墨多糖抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的活性及機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤已成為全球的主要致死疾病之一，而90％因腫瘤致死的患者機(jī)體內(nèi)發(fā)生了腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，研發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物對(duì)提高癌癥患者的存活率至關(guān)重要。由于具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤活性且毒副作用小，天然多糖抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移活性的研究已成為腫瘤藥物研究熱點(diǎn)之一。烏賊墨多糖SIP為本課題組從曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni)墨中首次分離到的一種結(jié)構(gòu)新穎的多糖。研究發(fā)現(xiàn)SIP硫酸化衍生物SIP-S能夠抑制腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP

2、-2)的表達(dá)和活性，并能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和內(nèi)皮細(xì)胞遷移。據(jù)此我們推測(cè)SIP-S具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。本課題不但深入研究了SIP-S在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的活性，而且于體外研究了其抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的活性作用機(jī)制。
　　1 SIP-S體內(nèi)抑瘤和免疫增強(qiáng)活性的研究。
　　本論文建立S180肉瘤細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型，并考察了SIP-S體內(nèi)抗腫瘤和免疫增強(qiáng)的活性。
　　單獨(dú)用藥考察結(jié)果表明，SIP-S具有顯著的抗腫瘤活性

3、和免疫增強(qiáng)活性。SIP-S單獨(dú)應(yīng)用能夠顯著抑制S180荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，給藥劑量為30、20和10mg/kg·d的模型動(dòng)物體內(nèi)的抑瘤率分別達(dá)到43.5、39.7和32.4％;與環(huán)磷酰胺(CTX)30mg/kg·d給藥組相比，SIP-S各劑量組瘤重均無顯著性差異(P＞0.05)，說明SIP-S具有顯著的抗腫瘤活性。此外，CTX給藥組的小鼠脾臟指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，而SIP-S給藥組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有輕微或顯著升高，說明S

4、IP-S具有免疫增強(qiáng)活性。
　　聯(lián)合用藥考察結(jié)果表明，SIP-S同樣具有良好的抗腫瘤活性。SIP-S(15mg/kg·d)與CTX(12.5 mg/kg·d)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的抗腫瘤活性高于SIP-S15(mg/kg·d)及CTX(25 mg/kg·d)單獨(dú)用藥的活性，并且對(duì)小鼠的免疫功能沒有顯著影響。從而證明SIP-S與CTX聯(lián)用具有協(xié)同增效作用，其免疫增強(qiáng)活性是其抗腫瘤活性的作用機(jī)制之一。
　　2 SIP-S抗腫瘤活性機(jī)制的體

5、外研究。
　　SIP-S體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有良好的抑制活性，且成時(shí)間和劑量依賴性。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SIP-S的體外抗腫瘤活性。檢測(cè)結(jié)果表明，500、100和20μg/mL的SIP-S對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，作用2天時(shí)抑制率分別為41.06％、32.48％和25.10％，而第7天時(shí)抑制率則分別提高到約為86.96％、67.39％和50.00％。結(jié)果說明SIP-S能夠

6、直接影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著時(shí)間和劑量的增大，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。
　　Annexin V-FITC/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，500、100、20μg/mL和0μg/mLSIP-S作用于SKOV3細(xì)胞，36 h后細(xì)胞的早期凋亡比率分別為8.54％、3.66％、1.79％和3.18％，壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞比率分別為17.41％、6.44％、5.76％和3.90％，證明SIP-S能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，Western b

7、lot結(jié)果表明SIP-S能明顯抑制SKOV3細(xì)胞內(nèi)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP-1)的表達(dá)和上調(diào)促凋亡蛋白caspase-3、-8、-9和bax的表達(dá)水平，但是對(duì)bcl-2和caspase-10的表達(dá)無顯著影響。該結(jié)果同時(shí)證明這種胞內(nèi)調(diào)節(jié)活性呈一定劑量依賴性。
　　以上結(jié)果說明SIP-S能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　3 SIP-S抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的研究。

8、>　　SIP-S體內(nèi)不但有抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，還能抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。通過建立小鼠黑色素瘤B16F10人工肺轉(zhuǎn)移模型，本論文考察SIP-S的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移活性。結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，SIP-S30和15 mg/kg·d劑量組均能顯著抑制小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)（P＜0.01），抑制率分別為87.95和85.94％。此外，陰性對(duì)照組部分動(dòng)物出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)生長(zhǎng)過大致肺部完全受到侵襲以及肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但藥物組均未出現(xiàn)此種情況，表明SIP-S體內(nèi)不但有抗

9、腫瘤轉(zhuǎn)移活性，還能抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。HE病理切片可見藥物組腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)細(xì)胞核異型較少，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)上堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)量較生理鹽水組降低。這可能是SIP-S抗轉(zhuǎn)移活性的作用機(jī)制之一。
　　4 SIP-S抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。
　　本論文推測(cè)SIP-S通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和抑制乙酰肝素酶的活性來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。
　　分別采用MTT法、

10、流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫法和Western blot檢測(cè)，本論文分析了SIP-S對(duì)腫瘤細(xì)胞黏附能力、P-選擇素/配體結(jié)合、乙酰肝素酶活性以及細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，SIP-S能夠較好的抑制SKOV3細(xì)胞與Matrigel膠的黏附，SIP-S500、100和20μg/mL濃度下作用40 min后的黏附抑制率分別為65.10％、54.40％和38.41％，作用80 min后的黏附抑制率分別為68.53％、58.27％和42.

11、76％。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示SIP-S能夠抑制重組P-選擇素/Fc嵌合蛋白(P-Fc)與表達(dá)其配體P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)的HL-60細(xì)胞的結(jié)合，SIP-S5和1 mg/mL的抑制率分別為23.81％和20.19％。此外，SIP-S能夠顯著抑制乙酰肝素酶對(duì)底物硫酸乙酰肝素和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，SIP-S10和5μg/mL濃度下的抑制率大于60％，與陽性對(duì)照藥肝素的抑制活性相當(dāng)，說明SIP-S能顯著抑制乙酰肝素酶的活性。West

12、ern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SIP-S能明顯抑制SKOV3細(xì)胞上黏附分子ICAM-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、整合素β1(integrinβ1)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞融合細(xì)胞EA.hy926上E-選擇素的表達(dá)，但是對(duì)SKOV3細(xì)胞上E-鈣黏素、CD44V6和EA.hy926細(xì)胞上VCAM-1和的表達(dá)沒有顯著影響。以上結(jié)果皆證明SIP-S具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的黏附、抑制乙酰肝素酶的生物活性，我們推測(cè)這是SIP-S抗腫瘤

13、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　5 SIP-S抗血管生成活性的研究。
　　體外管腔形成實(shí)驗(yàn)表明SIP-S能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的活性。SIP-S500、100和20μg/mL作用一定時(shí)間，可見內(nèi)皮細(xì)胞小管形成數(shù)目減少，且管腔不完整，與陰性對(duì)照組比較差異顯著。建立雞胚尿囊膜模型檢測(cè)SIP-S體內(nèi)對(duì)血管生成的影響，與生理鹽水組相比，SIP-S2和0.4 mg/mL能夠顯

14、著抑制雞胚尿囊膜上的新生血管生成（P＜0.01）。以上結(jié)果證明SIP-S具有抗血管生成的活性。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SIP-S能明顯抑制SKOV3細(xì)胞上和內(nèi)皮細(xì)胞上血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF和bFGF的表達(dá)，這可能是其抗血管生成作用的機(jī)制之一。血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過程中均發(fā)揮重要作用。因此，推測(cè)SIP-S的抗血管生成活性是其抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移活性的作用機(jī)制之一。
　　6結(jié)論和意義。
　　本課題采用一系列體內(nèi)、體外

15、的方法確定了SIP-S抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的活性并初步揭示了SIP-S該類活性的作用機(jī)制。研究表明SIP-S體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SIP-S能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能、緩解化療藥物CTX所致的免疫損傷、降低腫瘤細(xì)胞的黏附能力、抑制乙酰肝素酶的活性并抑制新生血管生成，這些活性是SIP-S抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　本課題研究證明了SIP-S是一種具有良好的抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)