獲得性重型再生障礙性貧血患者外周血淋巴細胞穿孔素基因突變檢測及mRNA表達分析.pdf

1、目的：檢測獲得性重型再生障礙性貧血(SAA)患者外周血淋巴細胞基因組DNA穿孔素基因(PRF)編碼序列突變形式及rs882822 SNP位點基因型、等位基因分布特點；檢測SAA患者外周血淋巴細胞穿孔素mRNA表達水平，探索穿孔素基因與SAA發(fā)病之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增31例SAA患者及15名正常對照外周血淋巴細胞基因組DNA穿孔素基因(PRF1)外顯子2(EXON2)及外顯子3(EXON3

2、)，雙脫氧終止法測序，用generunner-軟件將所得序列與GenBank報道序列核對尋找基因突變位點；發(fā)現(xiàn)有突變序列將基因組克隆入M13噬菌體載體中，對所得兩條染色體相應(yīng)序列分別測序，以確定不同突變在染色體上的分布；根據(jù)測序峰圖核對rs885822 SNP位點基因型分布，應(yīng)用卡方檢驗統(tǒng)計方法計算rs885822SNP位點基因型分布是否符合遺傳平衡(哈代-韋伯格平衡)，應(yīng)用卡方檢驗方法計算rs885822 SNP位點基因型及等位基因頻

3、率在SAA患者和正常對照是否存在差異；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法提取SAA患者外周血淋巴細胞mRNA，PCR擴增穿孔素mRNA，瓊脂糖凝膠電泳，gel pro軟件進行半定量分析。獨立樣本T檢驗方法比較SAA患者與正常人外周血淋巴細胞穿孔素mRNA表達是否存在差異。
　　 結(jié)果：通過對31例SAA患者及15名正常人的外周血淋巴細胞基因組DNA穿孔素基因外顯子2和外顯子3直接測序，在一例女性SAA患者發(fā)現(xiàn)有822位C>T堿

4、基突變，突變類型為純合子突變，此堿基突變對氨基酸序列無影響。在一例男性SAA患者，發(fā)現(xiàn)907位G>A堿基突變，突變類型為雜合子突變，對氨基酸序列的影響為303位甲硫氨酸變成纈氨酸(Met303Val)。在正常人中沒有發(fā)現(xiàn)存在突變樣本；發(fā)現(xiàn)一處單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)此位點已由SNP數(shù)據(jù)庫報道，編號rs885822。此位點的分布符合哈代-韋伯格平衡(P>0.05)，此位點基因型及等位基因頻率分布在病例組與對照組之間有明顯差異(P=0.