人參皂苷Rb1通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的研究.pdf

1、研究背景
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊破裂和血栓形成是導(dǎo)致急性心腦血管事件的主要病理機(jī)制，對(duì)可能發(fā)生破裂的易損斑塊(vulnerable plaque)進(jìn)行早期積極干預(yù)是預(yù)防和減低急性心腦血管事件的發(fā)生率的重要方法。AS是一種脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥性疾病。其主要病理表現(xiàn)為脂質(zhì)堆積和炎癥細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞在這一過程中發(fā)揮重要作用。血液中的低密度脂蛋白膽固醇被巨噬細(xì)胞吞噬后以膽固醇酯的形式存在于脂滴中，蓄積

2、了大量脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞。如何減少泡沫細(xì)胞中脂質(zhì)的蓄積，對(duì)于降低斑塊脂負(fù)荷、促進(jìn)斑塊穩(wěn)定具有重要意義。
　　人參皂苷Rb1是人參當(dāng)中含量最多的活性成分。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Rb1具有降低血脂、降低體重、對(duì)抗炎癥、抑制血管形成和增強(qiáng)胰島素敏感性等生理作用。但是，Rb1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用尚沒有研究。本課題擬通過構(gòu)建AS小鼠模型和體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，探討人參皂苷Rb1通過調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用及其相關(guān)機(jī)制。

3、
　　目的
　　通過構(gòu)建體外泡沫細(xì)胞模型及動(dòng)脈粥樣硬化小鼠易損斑塊模型，研究人參皂苷Rb1調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬、影響脂質(zhì)代謝及穩(wěn)定AS易損斑塊的分子機(jī)制。
　　方法
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，我們提取C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，給予ox-LDL(100μg/ml)刺激24小時(shí)誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞，然后分別給予不同濃度Rb1處理24小時(shí)。油紅O染色檢測(cè)各組細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況，western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3Ⅱ和SQS

4、TM1含量，電鏡觀察細(xì)胞中脂滴及自噬體膜形成數(shù)量;通過慢病毒轉(zhuǎn)染Atg5siRNA抑制細(xì)胞自噬過程，觀察干預(yù)自噬前后，Rb1對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響;給予AMPK抑制劑Compond C，研究AMPK磷酸化在Rb1介導(dǎo)的自噬中的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠20周構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化晚期斑塊模型。然后隨機(jī)分為兩個(gè)組，分別通過灌胃給予生理鹽水和人參皂苷Rb1(50mg/kg/d)，隔天一次給藥。干預(yù)7周后，病理學(xué)方法檢測(cè)斑塊

5、脂質(zhì)沉積、巨噬細(xì)胞浸潤、平滑肌數(shù)量以及膠原含量，并通過分子學(xué)檢測(cè)斑塊中自噬蛋白LC3 B和SQSTM1表達(dá)及AMPK磷酸化，探究Rb1影響斑塊穩(wěn)定性的可能機(jī)制。
　　結(jié)果
　　1.Rb1在20-80μM范圍內(nèi)濃度依賴性地降低了泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。
　　2.Rb1處理后細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加、SQSTM1降低，并且細(xì)胞中自噬雙層膜結(jié)構(gòu)增多，提示Rb1促進(jìn)了細(xì)胞的自噬水平。
　　3.經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染Atg5 s

6、iRNA抑制自噬后，Rb1降低泡沫細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用明顯減弱。
　　4.Rb1促進(jìn)了AMPK磷酸化，加入AMPK抑制劑compound C后，Rb1激活自噬的作用減弱。
　　5.與對(duì)照組相比，Rb1處理組小鼠斑塊自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加、SQSTM1降低，并且AMPK磷酸化增加。
　　6.與對(duì)照組相比，Rb1處理組小鼠斑塊脂質(zhì)沉積和巨噬細(xì)胞浸潤減少，膠原和平滑肌數(shù)量增多，斑塊穩(wěn)定性增加。
　　結(jié)論