酪氨酸酶七肽抑制劑的篩選及其柔性脂質(zhì)體的制備.pdf

1、酪氨酸酶(EC1.14.18.1)又稱多酚氧化酶，是一種含銅金屬酶，廣泛存在于微生物，昆蟲，植物及哺乳動物中，不同來源的酪氨酸酶具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。因此，研究能抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)成為治療色素沉著性疾病的重要手段。酪氨酸酶抑制劑還可以應(yīng)用于美白化妝品，生物殺蟲劑，果蔬保鮮等眾多領(lǐng)域。目前，對酪氨酸酶抑制劑的研究已成為熱點研究領(lǐng)域之一。
　　 本論文從展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫中篩選出了一種

2、酪氨酸酶抑制劑，對其進(jìn)行了抑制動力學(xué)研究，探討了抑制機(jī)理。制備了合適的載藥體系對該抑制劑進(jìn)行了包裹，研究了其透皮性能。
　　 論文主要內(nèi)容包括：
　　 利用噬菌體表面展示技術(shù)，以酪氨酸酶分子為靶分子，經(jīng)過三輪生物淘洗過程，獲得了10個對酪氨酸酶有特異性親和力的單克隆。對單克隆進(jìn)行擴(kuò)增和滴度測試后，通過ELISA測試，測定親和力最高的為3號克隆。擴(kuò)增該單克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行測序，編碼基因作為病毒基因組中的一部分通過分泌型噬菌

3、體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。該單克隆的序列為：Ile-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe(7AAP)。即展示在噬菌體顆粒表面，與酪氨酸酶分子親和性最強(qiáng)的是該序列的七肽。
　　 采用酶動力學(xué)方法，分別以L-酪氨酸和L-多巴為底物，驗證了7AAP對于酪氨酸酶活性的抑制作用。結(jié)果顯示7AAP對酪氨酸酶具有明顯的抑制作用，可抑制酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活力。對酪氨酸酶單酚酶的抑制效應(yīng)主要表現(xiàn)于酶催化反應(yīng)的延滯時間有明顯的延長，

4、Lineweaver-Burk圖顯示7AAP對二酚酶的抑制作用表現(xiàn)為可逆競爭性抑制。
　　 以人A375黑色素瘤細(xì)胞為受試細(xì)胞，設(shè)置不同的7AAP濃度(0，4.5，9.0，18.0，36.0，72.0，144.0，288.0，576.0，1152.0μmol/L)，探討7AAP對A375黑色素瘤細(xì)胞的形態(tài)，增殖活性，黑素合成以及酪氨酸酶活性的影響。顯微鏡下觀察，與對照組相比，7AAP對A375黑色素瘤細(xì)胞的形態(tài)無影響，濃度低于7

5、2μmol/L時，對人A375黑色素瘤細(xì)胞增殖無明顯影響。在4.5-72μmol/L濃度范圍內(nèi)，呈濃度依賴性抑制黑色素瘤細(xì)胞黑素生成。為探討這種黑素生成抑制作用是否與酪氨酸酶有關(guān)，進(jìn)一步檢測了7AAP對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果顯示，與黑素生成抑制作用相似，在4.5.72μmol/L濃度范圍內(nèi)，7AAP呈濃度依賴性抑制酪氨酸酶活性。結(jié)果表明在4.5-72μmol/L，濃度范圍內(nèi)，7AAP具有抑制黑素細(xì)胞合成和酪氨酸酶活性的功能，而

6、不是依靠降低細(xì)胞增殖率而減少相對黑素的含量。
　　 對7AAP應(yīng)用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)進(jìn)行了初步探索，以大豆卵磷脂，膽固醇為原料，采用逆相蒸發(fā)法、薄膜分散法、薄膜超聲法三種方法制備了載7AAP納米脂質(zhì)體。對其進(jìn)行了粒徑，Zeta電位，回收率，包封率的測定等表征。動態(tài)光散射的結(jié)果顯示，由逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體粒徑分布最均勻，范圍較窄。場發(fā)射掃描電鏡下觀察，脂質(zhì)體呈白色球狀或橢球狀，絕大部分為單室脂質(zhì)體。采用逆向蒸發(fā)法，分別以磷脂：膽酸鈉