谷氨酰胺對(duì)牛瘤胃上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的影響.pdf

1、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)因其具有獨(dú)特而復(fù)雜的生理功能，已成為營養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)、營養(yǎng)免疫學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，特別在維持腸道健康狀態(tài)或修復(fù)病理腸道結(jié)構(gòu)中具有重要作用。目前瘤胃 pH過低造成瘤胃上皮細(xì)胞（ Ruminal Epithelium Cell,REC）受到一定損傷的問題依然存在， Gln是否對(duì)酸損傷的REC有修復(fù)作用仍未可知。因此，本試驗(yàn)以 Gln對(duì)體外培養(yǎng)的損傷REC的影響為研究主題,初步探索Gln在瘤胃上皮生長及

2、損傷修復(fù)中的作用機(jī)理。
　　實(shí)驗(yàn)一：REC原代分離和培養(yǎng)
　　首先用9種不同種類和劑量的抗生素洗滌液沖洗瘤胃上皮組織；然后采用0.25％胰蛋白酶+0.02%EDTA在不同條件下對(duì)瘤胃上皮進(jìn)行連續(xù)消化和分步消化以及先用0.1%膠原酶 I消化再用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在37℃分步消化。結(jié)果表明：瘤胃上皮分別經(jīng)過6倍青鏈霉素和6倍慶大霉素洗滌液的清洗后能有效去除瘤胃上皮表面微生物，瘤胃上皮先經(jīng)過0.1%膠原酶 I消

3、化30min再經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA分步消化后可獲得較多的且活性較高的上皮細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞純化與鑒定
　　分別使用細(xì)胞刮除法，差速貼壁法，相差消化法三種不同方法進(jìn)行細(xì)胞純化，繪制相應(yīng)的細(xì)胞生長曲線，使用 HE染色方法和流式細(xì)胞技術(shù)分別從形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果顯示：使用差速貼壁法純化后 REC純度在95%以上，呈典型的鋪路石狀，生長曲線呈―S‖型，活性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)三

4、：REC損傷模型的建立
　　根據(jù)牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒(Subacute Rumen Acidosis,SARA)時(shí)，瘤胃液pH及瘤胃液中各種揮發(fā)酸比例，設(shè)置四組試驗(yàn)：第一組為對(duì)照組：pH7.2正常培養(yǎng)基；第二組為用乳酸調(diào)整培養(yǎng)基 pH5.5組；第三組為用揮發(fā)酸100倍原液調(diào)整培養(yǎng)基 pH5.5組；第四組為用揮發(fā)酸+乳酸100倍原液調(diào)整培養(yǎng)基 pH5.5組。然后分別培養(yǎng)3、5、8、12、24 h，觀察每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生長及凋亡狀況。

5、然后分別測定上清液中 LDH、MDA、SOD、NO水平，以及細(xì)胞腫瘤壞死因子（ TNF-α），炎癥因子（ IL-1、IL-8），細(xì)胞間連接蛋白（ Claudin-1、occludin)，細(xì)胞表面受體（TLR-2、TLR-4）等基因 mRNA水平變化。結(jié)果顯示：酸處理后12h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)空泡，細(xì)胞間隙變大，隨后逐漸有細(xì)胞收縮，變形，漂起，呈明顯的凋亡現(xiàn)象。在3h時(shí)上清液中 LDH水平顯著升高（ P＜0.05）， SOD水平顯著下降（

6、 P＜0.05），細(xì)胞 TNF-α， L-1β、IL-8基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＞0.05），occludin的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），3h時(shí)細(xì)胞表面受體（TLR-2，TLR-4）基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而隨著酸處理時(shí)間的增加，細(xì)胞表面受體 mRNA相對(duì)表達(dá)量水平逐漸下降。說明：酸處理3h時(shí)，細(xì)胞已受到了損傷。所以使用揮發(fā)酸和乳酸共同處理細(xì)胞3h時(shí)即能產(chǎn)生較明顯損傷效果，能成功建立損

7、傷模型。
　　實(shí)驗(yàn)四：Gln對(duì)損傷模型的修復(fù)
　　用揮發(fā)酸+乳酸100倍原液調(diào)整培養(yǎng)基使pH5.5，培養(yǎng)3 h后，換含有不同濃度Gln的培養(yǎng)基（Gln濃度分別為4、8、12、32 mM/L）進(jìn)行修復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞。同樣檢測上清液成分及細(xì)胞相應(yīng)腫瘤壞死因子、細(xì)胞表面受體、炎癥因子、細(xì)胞間連接蛋白等 mRNA水平。結(jié)果顯示：低濃度的Gln細(xì)胞上清液中 LDH水平較高；高濃度的Gln組其水平較低，TNF