人CD55抗原模擬表位的篩選及其對乳腺癌細(xì)胞的抑瘤作用研究.pdf

1、目的：利用噬菌體肽庫展示技術(shù)從Ph.D.12噬菌體肽庫中篩選能夠和人CD55單克隆抗體（CD55 McAb）特異性結(jié)合的短肽，從中找到CD55的抗原模擬表位，設(shè)計(jì)出與人腫瘤免疫逃逸蛋白CD55同源的的短肽，為腫瘤治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：以人CD55單克隆抗體為靶標(biāo)，Ph.D.12肽庫通過4輪噬菌體篩選淘選出與CD55單克隆抗體特異性結(jié)合的短肽，計(jì)算每輪回收率。4輪篩選后，隨機(jī)挑選11個噬菌體單克隆和野生型噬菌體進(jìn)行競爭結(jié)合，

2、計(jì)算其結(jié)合力。利用ELISA、競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定篩選出結(jié)合力強(qiáng)的噬菌體單克隆，E.coliER2378宿主菌表達(dá)和純化噬菌體。將陽性噬菌體克隆交由公司測序，測序結(jié)果里找出出現(xiàn)頻率高的短肽序列，設(shè)計(jì)與人CD55單克隆抗體具有高親和性及特異性的短肽，并對其體外抗乳腺癌作用效果進(jìn)行研究。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測CD55抗原模擬表位對乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞）增殖的影響。熒光顯微鏡驗(yàn)證短肽在細(xì)胞中的攝入和分布。透射電鏡（Trans

3、mission electron microscopy, TEM）和流式細(xì)胞術(shù)檢測該短肽在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞凋亡中的影響。
　　結(jié)果：4輪篩選后，每輪噬菌體回收率都達(dá)到了較高數(shù)量級。競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示11個噬菌體單克隆和第3、4輪篩選后的噬菌體都與CD55單克隆抗體親和力都非常顯著。ELISA結(jié)果顯示有8個噬菌體單克隆和CD55單克隆抗體親和力顯著。根據(jù)測序結(jié)果得到兩條高表達(dá)短肽序列 HAHTPT

4、RGVMHA（簡稱 H肽）和QVNGLGERSQQM（簡稱Q肽）。CCK8實(shí)驗(yàn)證明Q短肽序列對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的毒性作用顯著且具有劑量依賴性，而H短肽較Q肽藥效較差，達(dá)到相同抑瘤率所需作用濃度較高。熒光顯微鏡觀察到Q短肽分布在細(xì)胞膜表面。透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)顯示Q短肽具有誘導(dǎo)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)論：利用噬菌體隨機(jī)12肽庫成功得到兩條CD55單克隆抗體特異性結(jié)合的CD