使用原基分布圖技術(shù)研究觀察異氟烷對(duì)新生小鼠的神經(jīng)毒性.pdf

1、大量研究證實(shí)，麻醉藥物于發(fā)育期的動(dòng)物具有神經(jīng)毒性作用。但在其導(dǎo)致神經(jīng)毒性的過程中，哪些細(xì)胞死亡或者得以幸存，目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)使用基因標(biāo)記的原基分布圖（fate-map）來(lái)標(biāo)記發(fā)育中或是成年小鼠的大腦內(nèi)的新生細(xì)胞，以此來(lái)識(shí)別對(duì)麻醉藥物致神經(jīng)毒性敏感的細(xì)胞種類。
　　本實(shí)驗(yàn)選用Gli-CreERT2種系的小鼠，Gli是啟動(dòng)子，用他莫昔芬可以誘導(dǎo)Cre重組酶的表達(dá)。Gli種系小鼠與綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因小鼠雜交獲得的雙轉(zhuǎn)基因

2、下代被用于本實(shí)驗(yàn)。Gli-CreERT2∷GFP雙轉(zhuǎn)基因小鼠出生后7天，給予皮下注射250mg/kg他莫昔芬激活Cre重組酶，切除GFP基因兩端的終止密碼子，海馬區(qū)域內(nèi)表達(dá)Gli的顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞及其后代細(xì)胞自此將持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白，借此可觀察GFP表達(dá)細(xì)胞來(lái)評(píng)估神經(jīng)元的生存情況和形態(tài)學(xué)改變。為觀察異氟烷對(duì)新生小鼠發(fā)育中的大腦的影響，本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分:
　　(1)異氟烷對(duì)小鼠發(fā)育中大腦的短期影響
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是觀察

3、新生小鼠在接受異氟烷麻醉后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。皮下注射他莫西芬兩周后，即小鼠出生后21天(P21)，小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組（吸入空氣6小時(shí)）或麻醉組（吸入1.5％異氟烷6小時(shí)）。立即給予腹腔注射氯胺酮+乙酰丙嗪+甲苯噻嗪混合溶液，經(jīng)心臟灌注肝素化PBS溶液，再灌注甲醛溶液、取腦，并在甲醛溶液內(nèi)固定、冷凍。冰凍切片成60μm的組織薄片，用GFP和Caspase-3（用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞凋亡）免疫熒光染色。利用共聚焦顯微鏡分別對(duì)齒狀回上支中部和下支中

4、部分層掃描。用Neurolucida軟件導(dǎo)入分層圖像，對(duì)表達(dá)GFP和/或Caspase-3的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)觀察同時(shí)表達(dá)GFP+caspase-3細(xì)胞的形態(tài)。由不知分組情況的觀察者進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞形態(tài)評(píng)估。
　　與對(duì)照組相比，麻醉組GFP細(xì)胞的數(shù)量和分布位置差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，caspase-3表達(dá)細(xì)胞密度顯著增加（上支:對(duì)照組:22071±6547/mm3，麻醉組:119220±14566/mm3，P＜0.001;下支:麻醉組

5、:對(duì)照組:47283±7870/mm3，209634±15732/mm3，P＜0.001）;GFP細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Caspase-3的細(xì)胞比例增加(上支:對(duì)照組0.9％，麻醉組22.9％，P＜0.001;下支:對(duì)照組2.7％，麻醉組27.7％，P＜0.001P＜0.001)，且形態(tài)發(fā)生退變變性，主要表現(xiàn)為樹突抽回和卷邊。
　　(2)異氟烷對(duì)于新生小鼠大腦的長(zhǎng)期影響
　　本部分實(shí)驗(yàn)的目的是觀察新生小鼠在接受異氟烷麻醉后神經(jīng)細(xì)胞凋

6、亡是否長(zhǎng)期存在。皮下注射他莫西芬兩周后，小鼠P21天時(shí)，小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組（吸入空氣6小時(shí)）或麻醉組（吸入1.5％異氟烷6小時(shí)），結(jié)束后待麻醉組小鼠清醒后，與對(duì)照組小鼠一起，放回其各自母鼠籠內(nèi)，P28天予以斷奶、分籠。小鼠P81天，給予腹腔注射氯胺酮+乙酰丙嗪+甲苯噻嗪混合溶液，經(jīng)心臟灌注肝素化的PBS溶液，再灌注甲醛溶液、取腦，并在甲醛溶液內(nèi)固定、冷凍。冰凍切片成60μm的組織薄片，用GFP和Caspase-3、或GFP、Calre

7、tinin和Ki-67染色。利用共聚焦顯微鏡對(duì)齒狀回嵴部上支中部和下支中部逐層分層掃描。用Neurolucida軟件導(dǎo)入分層圖像，分別對(duì)表達(dá)GFP、Caspase-3、Calretinin（標(biāo)記未成熟的顆粒細(xì)胞）、Ki-67（標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)）的細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)GFP+Calretinin或GFP+Ki-67的細(xì)胞，在齒狀回門區(qū)和分子層的異位GFP標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。由不知分組情況的觀察者來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　本實(shí)驗(yàn)的第一部分，麻醉導(dǎo)

8、致22.9-27.7％的GFP標(biāo)記細(xì)胞凋亡，若這些凋亡的GFP細(xì)胞在60天內(nèi)未恢復(fù)，則本部分實(shí)驗(yàn)中也應(yīng)觀察到與對(duì)照組相比，麻醉組的GFP標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量大約要少22.9-27.7％。而實(shí)際上，對(duì)照組和麻醉組的GFP標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量和分布位置差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在麻醉后60天內(nèi)，神經(jīng)細(xì)胞可能通過存活的神經(jīng)祖細(xì)胞增加細(xì)胞增殖得到恢復(fù)。同時(shí)，與對(duì)照組一樣，麻醉組幾乎未見到Caspase-3表達(dá)細(xì)胞，提示異氟烷麻醉后顆粒細(xì)胞不會(huì)持續(xù)大量凋亡。與對(duì)照

9、組相比，麻醉組GFP標(biāo)記細(xì)胞中表達(dá)Calretinin的細(xì)胞比例和表達(dá)Ki-67的細(xì)胞比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在麻醉后60天內(nèi)，恢復(fù)過程已經(jīng)完成。在齒狀回門區(qū)和顆粒細(xì)胞分子層的異位GFP表達(dá)細(xì)胞在兩組間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示麻醉后的神經(jīng)元細(xì)胞遵循正常模式遷移。
　　本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)來(lái)標(biāo)記齒狀回顆粒細(xì)胞，提示兩周左右的神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)于異氟烷的神經(jīng)毒性非常敏感。同時(shí)表明異氟烷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可隨時(shí)間恢復(fù)。這種原基分布圖技術(shù)