順鉑，紫杉醇對肺癌細(xì)胞A549，H520中癌基因mdig表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　Mdig基因(Mineral dust-induced gene)，即礦物粉塵誘導(dǎo)基因，2005年首先在礦工的肺泡巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并被證實是一種肺癌相關(guān)基因。與MINA53(Myc-induced nuclear antigen with a molecular mass of53kDa)是同源基因，因為MDIG蛋白主要分布在細(xì)胞核，所以還稱之為核仁蛋白52(Nucleolar protein52，NO52)。Mdi

2、g在肺癌細(xì)胞株及肺癌組織中表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且在部分肺癌患者中其表達(dá)水平高于癌旁正常肺組織。目前，mdig已在人類多種惡性腫瘤中被檢測，食道癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、膽管癌、齒齦癌、淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、胰腺癌及乳腺癌等。由此表明mdig是一個新的腫瘤相關(guān)基因。
　　肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)WHO2003年公布的資料，肺癌的發(fā)病率（120萬/年）和死亡率（110萬/年）均居全球癌癥的首位，發(fā)病率和死亡率

3、仍在迅速上升。其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的大部分，約為85％。我國肺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，自2000年到2005年對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。60％～80％的肺癌患者在診斷時已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，因此肺癌的治療多采用以化療為主的綜合治療。
　　順鉑(Cisplatin，DDP)，是含鉑的抗癌藥物，即順式-二氯二氨合鉑，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，是治療肺癌最常用的化療藥物之一。在細(xì)胞內(nèi)順鉑先將分子中的氯解離然后與DNA上

4、的鳥嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成DNA單鏈內(nèi)兩點(diǎn)的交叉聯(lián)接也可能形成雙鏈間的交叉聯(lián)結(jié)從而破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能。
　　紫杉醇(Paxol)，是細(xì)胞有絲分裂抑制劑，通過促進(jìn)微管蛋白正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體形成，進(jìn)而阻止癌細(xì)胞增生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　雖然化療藥物種類繁多，但是化療的效果在不同患者間差異很大，研究表明，對化療藥物耐藥是化療失敗的主要原因，因此尋找化療敏感相關(guān)性基因在肺癌的化療治療中起著重要的作用。<

5、br>　　本實驗通過向體外培養(yǎng)的A549和H520細(xì)胞中加入化療藥物順鉑和紫杉醇，觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖的變化，以及加藥后細(xì)胞內(nèi)MDIG蛋白表達(dá)改變，并通過觀察用藥后細(xì)胞增殖與MDIG蛋白改變的關(guān)系，來探討mdig是否可能為化療敏感基因。
　　材料與方法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人類肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購于南京凱基生物公司，人類肺鱗癌細(xì)胞系H520購于北京腫瘤研究所。細(xì)胞培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)

6、+10％胎牛血清(Biological Industries)。在37℃、5％CO2的條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)中培養(yǎng)。
　　二、藥物干預(yù)
　　將A549細(xì)胞，H520細(xì)胞接種于六孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，36小時，48小時，將不同濃度的順鉑(8，4，2，1，0.5)μg/μl，紫杉醇(20，10，5，2.5，1.25)μg/μl溶液，滴入培養(yǎng)基中。
　　三、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
　　將加藥后

7、的六孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時，36小時，48小時后，用倒置顯微鏡下觀察不同藥物濃度作用不同時間的細(xì)胞形態(tài)變化情況。
　　四、細(xì)胞生存率實驗
　　A549，H520細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞貼壁后，向各孔中加入不同濃度的順鉑及紫杉醇，分別于24，36，48小時后每孔加入10μlCCK溶液(Biosharp，美國)，放入37℃溫箱中孵育4小時后，用酶標(biāo)儀測定各孔450nm波長的吸光度，每個樣本設(shè)

8、3個復(fù)孔。并設(shè)只加細(xì)胞不加藥物的為空白組，只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞及藥物的為凋零孔。
　　五、蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測
　　提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，最后用相應(yīng)的抗體檢測MDIG蛋白。
　　六、統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用pearson檢驗，p＜0.0

9、5具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、A549細(xì)胞對順鉑，紫杉醇敏感，細(xì)胞存活率與藥物量效有關(guān)系，應(yīng)用藥物后，兩種細(xì)胞內(nèi)MDIG蛋白表達(dá)均有下降;
　　2、H520細(xì)胞對順鉑敏感，應(yīng)用藥物后細(xì)胞存活率與藥物有量效關(guān)系，細(xì)胞內(nèi)mdig表達(dá)下降;而對紫杉醇不敏感，應(yīng)用藥物后細(xì)胞存活率改變差異不明顯，細(xì)胞內(nèi)MDIG蛋白無明顯改變。
　　結(jié)論：
　　mdig的表達(dá)量與用藥后細(xì)胞增殖情況密切相關(guān)，考慮mdig可能是