魔芋甘露聚糖肽的分離純化及抗腫瘤活性研究.pdf

1、甘露聚糖肽(Mannatide)是我國(guó)首創(chuàng)的一種新型生物反應(yīng)修飾物和生物免疫增強(qiáng)劑，其作用包括調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和增強(qiáng)自身抗腫瘤能力。目前，國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用的甘露聚糖肽主要從α-溶血性鏈球菌培養(yǎng)液中提取，來源單一，因此探索甘露聚糖肽的其它來源和制備方法已成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)。我國(guó)是魔芋精粉生產(chǎn)大國(guó)，魔芋飛粉作為精粉加工過程中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量較大，約占精粉質(zhì)量的30％～40％。但長(zhǎng)期以來，人們對(duì)魔芋飛粉的研究應(yīng)用很少，大部分被直接廢棄或當(dāng)動(dòng)物飼料使

2、用，甚至造成環(huán)境污染。經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究工作發(fā)現(xiàn)，飛粉中含有豐富的魔芋蛋白和葡甘聚糖，是制備魔芋甘露聚糖肽的良好資源。
　　本研究以魔芋飛粉為原料，采用堿溶酸沉法提取魔芋蛋白，再通過酶解法制備魔芋多肽。之后采用硫酸銨沉淀法提取酶解液中的魔芋糖肽，再經(jīng)過DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex G-75柱層析和ConA-Sepharose4B柱層析的分離、純化得到魔芋甘露聚糖肽，并對(duì)其進(jìn)行了分析及抗腫瘤活性檢測(cè)。具體研究結(jié)果如

3、下:
　　1.以魔芋飛粉為原料，采用堿溶酸沉法提取魔芋蛋白，再利用堿性蛋白酶水解魔芋蛋白制備魔芋多肽，測(cè)得多肽得率為13.68％，水解度為10.32％。在此基礎(chǔ)上研究了魔芋糖肽提取工藝，采用硫酸銨沉淀法提取酶解液中的魔芋糖肽，以糖肽提取率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化魔芋糖肽提取工藝。結(jié)果表明:在實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定范圍內(nèi)，硫酸銨加入量對(duì)糖肽提取率影響顯著，pH和沉淀時(shí)間對(duì)糖肽提取率影響不顯著;硫酸銨沉淀法提取魔芋糖肽的最佳工藝條件

4、為:硫酸銨加入量為70％飽和度、pH4.5、沉淀時(shí)間10h，此工藝下的糖肽提取率為17.21％。
　　2.研究了魔芋甘露聚糖肽的分離純化方法。采用DEAE-52纖維素柱層析對(duì)魔芋甘露聚糖肽進(jìn)行初步分離，得到1個(gè)糖、肽吸收共有峰，并通過對(duì)洗脫條件的優(yōu)化，確定DEAE-52纖維素柱層析的最佳分離條件為:洗脫劑為蒸餾水和0.05、0.1、0.2 mol/L的NaCl溶液，上樣量2mL，洗脫流速0.8 mL/min;再采用Sephadex

5、 G-75柱層析對(duì)魔芋甘露聚糖肽進(jìn)行分離，得到1個(gè)糖、肽吸收共有峰，并優(yōu)化出Sephadex G-75柱層析的最適洗脫流速為1.0 mL/min;進(jìn)一步采用ConA-Sepharose4B柱層析純化魔芋甘露聚糖肽，以吸附率為指標(biāo)，探討不同離子強(qiáng)度和pH對(duì)魔芋甘露聚糖肽在ConA-Sepharose4B填料上吸附率的影響，確定最佳吸附條件為:NaCl濃度0.15 mol/L、pH7.5。以脫附率為指標(biāo)，考察不同α-甲基-D-甘露糖苷濃度對(duì)

6、魔芋甘露聚糖肽在ConA-Sepharose4B填料上脫附率的影響，優(yōu)選出最適α-甲基-D-甘露糖苷濃度為0.2 mol/L。
　　3.采用高效液相色譜法，對(duì)魔芋甘露聚糖肽進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果表明，魔芋甘露聚糖肽含有與甘露聚糖肽對(duì)照品相似的氨基酸組成;魔芋甘露聚糖肽中的單糖主要為甘露糖和葡萄糖。運(yùn)用SDS-PAGE電泳測(cè)定魔芋甘露聚糖肽分子量范圍為20.1～42.7ku。利用紫外-可見分光光度法，通過繪制的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算純化后樣

7、品中魔芋甘露聚糖肽含量為79.51％。
　　4.采用MTT法對(duì)魔芋甘露聚糖肽進(jìn)行抗腫瘤活性檢測(cè)，結(jié)果表明，魔芋甘露聚糖肽對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116和肝癌細(xì)胞HepG2的增殖均具有一定抑制作用，且在1～100μmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的劑量依賴性，其中魔芋甘露聚糖肽對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的選擇性優(yōu)于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，對(duì)其增殖的抑制作用更為顯著。利用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算魔芋甘露聚糖肽對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-11