RNA干擾AKT2對胰腺癌吉西他濱化療敏感性的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后很差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，該疾病早期診斷十分困難，治療方法相當(dāng)有限，總體死亡率很高。在西方發(fā)達國家，胰腺癌的總體死亡率已由第5位升至第4位。而在中國，胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤的三大死亡原因之一，85%的患者在初次就診時已屬晚期，根治性胰腺癌手術(shù)切除率僅為10%～15%，5年總體生存率不到5%。目前化學(xué)治療仍是胰腺癌綜合治療的重要手段之一。吉西他濱屬于新一代阿糖胞苷類似物，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)可以有效改善晚期

2、胰腺癌患者的疾病相關(guān)癥狀和并提高患者生活質(zhì)量，于1996年被美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準正式取代5-氟尿嘧啶成為抗胰腺癌一線藥物，并被廣泛視作臨床研究的―金標準。1997年一項關(guān)于吉西他濱的Ⅲ期臨床試驗顯示，吉西他濱可顯著改善患者癥狀、延長患者中位生存期并使患者受益。但是惡性腫瘤化療的耐藥性是影響化療效果、疾病預(yù)后的最大問題。如何提高吉西他濱為主的胰腺癌化療敏感性成為當(dāng)前臨床研究和實驗研究的熱點問題。
　　 近年以來，

3、已經(jīng)有多項實驗研究顯示PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)與惡性腫瘤化療耐藥關(guān)系十分密切。多藥耐藥基因(mdr-1)家族是研究最早的目前公認的惡性腫瘤多藥耐藥相關(guān)基因。多藥耐藥基因的過度表達導(dǎo)致惡性腫瘤細胞生存力增強，抗化療藥物及抗凋亡能力增強，從而降低多種腫瘤化療藥物的細胞毒性作用。而這個過程受很多因素影響，其中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)在其中發(fā)揮了十分重要的作用。已有多項研究表明PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)通過上調(diào)(mul

4、tidrugresistance-related protein 1，MRP1)MRP1的表達而導(dǎo)致惡性腫瘤細胞產(chǎn)生化療耐藥現(xiàn)象，MRP1基因表達水平與PI3K/Akt信號通路表達水平在急性髓性白血病細胞中呈正相關(guān)性關(guān)系。另有研究利用傳統(tǒng)的PI3K 抑制劑渥曼青霉素來抑制Akt基因的磷酸化活化之后，MRP1基因的表達水平也隨之下降。Abdul-Ghani等的實驗研究也表明PI3K/Akt信號通路可以顯著上調(diào)MRP1基因的表達水平，從而降

5、低惡性細胞的凋亡，而另一種PI3K/Akt信號通路的抑制劑LY294002 能夠使惡性腫瘤細胞凋亡率大幅度提高。
　　 以上這些結(jié)果均提示我們沉默AKT基因表達可能成為臨床上增加胰腺癌化療敏感性的一種可行性的方法。
　　 按照以上實驗設(shè)想并在我的導(dǎo)師王春友教授的指導(dǎo)和支持下，我在我院普外科實驗室開展了RNA干擾AKT2對胰腺癌吉西他濱化療敏感性的影響及相關(guān)機制研究。為此，我們通過(1)RNA干擾胰腺癌細胞AKT2的表達對

6、吉西他濱敏感性的體外實驗，(2)RNA干擾AKT2對胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他濱敏感性的體內(nèi)實驗，這兩部分來觀察RNA干擾AKT2對胰腺癌吉西他濱化療敏感性的影響。然后通過(3)建立胰腺癌吉西他濱耐藥細胞系，(4)RNA干擾AKT2表達逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞耐藥的實驗研究，這兩部分來初步探討RNA干擾AKT2對改變胰腺癌耐藥性的相關(guān)機制。通過以上實驗為進一步闡明胰腺癌化療耐藥的分子生物學(xué)機理，從而在分子水平上尋找其中的關(guān)鍵基因并開發(fā)相應(yīng)靶向治療，

7、達到提高胰腺癌化療療效提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分：PANC-1細胞中AKT2的表達對吉西他濱敏感性的實驗研究
　　 目的：
　　 研究胰腺癌細胞Panc-1中AKT2的表達對吉西他濱敏感性的影響。
　　 方法：
　　 在體外條件下將AKT2特異性siRNA表達載體pAKT2-siRNA轉(zhuǎn)染至胰腺癌細胞株P(guān)anc-1，應(yīng)用RT-PCR、Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染siRNA后Panc-1

8、細胞中AKT2基因mRNA和蛋白的表達變化，應(yīng)用MTT法檢測RNA干擾AKT2后Panc-1細胞對吉西他濱敏感性的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 轉(zhuǎn)染AKT2 siRNA后Panc-1細胞AKT2基因mRNA和蛋白的表達水平顯著下降；吉西他濱對Panc-1細胞的半數(shù)細胞抑制量從1.96±0.22μg/ml降到0.24±0.03μg/ml，Panc-1細胞對吉西他濱的敏感性顯著增加。
　　 結(jié)論：
　　 A

9、KT2 siRNA 能夠抑制AKT2表達，并能增加胰腺癌細胞株P(guān)anc-1對吉西他濱的敏感性。
　　 第二部分：RNA干擾AKT2對人胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他濱敏感性的實驗研究
　　 目的：
　　 研究RNA干擾AKT2對人胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他濱敏感性的影響。
　　 方法：
　　 首先構(gòu)建荷胰腺癌的裸鼠模型，采用腹腔給藥和瘤內(nèi)注射方式，以吉西他濱配合AKT2 siRNA表達載體對瘤鼠進行聯(lián)合干

10、預(yù)治療以對比觀測各組裸鼠腫瘤生長情況，RT-PCR檢測各組腫瘤細胞的AKT2 mRNA表達情況，免疫組織化學(xué)法檢測各組腫瘤AKT2 蛋白表達，DNA 末端原位標記法(TUNEL法)檢測各組腫瘤組織細胞的凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 化療+AKT2-siRNA組移植瘤組織中AKT2 mRNA 及AKT2 蛋白表達顯著低于空白對照組、化療組以及化療+陰性質(zhì)粒組?；?AKT2-siRNA組腫瘤重量、腫瘤體積顯著低于其他各對

11、照組?；?AKT2-siRNA組抑瘤率、凋亡指數(shù)顯著高于其他各對照組。
　　 結(jié)論：
　　 RNA干擾AKT2 能夠顯著提高胰腺癌吉西他濱化療的敏感性。
　　 第三部分：胰腺癌吉西他濱化療耐藥細胞系的建立及其特性鑒定
　　 目的：
　　 建立胰腺癌吉西他濱化療耐藥細胞系，并對該細胞系的生物學(xué)特性進行研究。
　　 方法：
　　 通過逐步遞增細胞培養(yǎng)基中吉西他濱的濃度，建立對吉西他濱

12、化療耐藥的胰腺癌細胞系Panc1-Gem。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法和集落形成實驗兩種方法，計算出Panc1和Panc1-Gem 兩種細胞系的半數(shù)細胞抑制濃度(IC50)及耐藥系數(shù)(RI)：對比觀察Panc1和Panc1-Gem 兩細胞系的生長曲線，并計算出Panc1和Panc1-Gem 兩細胞系的倍增時間。
　　 結(jié)果：
　　 吉西他濱對Panc1的IC50為1.96±0.22μg/ml和吉西他濱對Panc1-Ge

13、m的IC50為239.82±35.47 μg/ml，MTT所測的RI 值為122.36(P<0.05)。集落形成實驗的所得RI為118.93。根據(jù)生長曲線計算出Panc1的倍增時間為27.1h，Panc1-Gem的倍增時間為35.2h。
　　 結(jié)論：
　　 已成功構(gòu)建了對吉西他濱化療耐藥的胰腺癌細胞系Panc1-Gem，耐藥性能十分明顯而穩(wěn)定,該細胞系適合用于胰腺癌吉西他濱化療耐藥的研究。
　　 第四部分：AKT

14、2 在胰腺癌細胞吉西他濱化療耐藥中的作用
　　 目的：
　　 研究AKT2、多藥耐藥基因(mdr-1）以及脫氧胞苷激酶(dCK)，在人胰腺癌細胞系Panc-1 吉西他濱(GEM)化療耐藥中的相互關(guān)系及調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 通過逐步增加藥物濃度的方法，誘導(dǎo)建立了耐吉西他濱的胰腺癌細胞系。應(yīng)用RNA干擾耐吉西他濱的胰腺癌細胞系A(chǔ)KT2表達來進行逆轉(zhuǎn)化療耐藥實驗，并采用了Western Blot、RT

15、-PCR 以及MTT法，來評價AKT2與mdr-1、dCK 兩個基因表達情況的相互調(diào)控關(guān)系及評估逆轉(zhuǎn)化療耐藥的效果。
　　 結(jié)果：
　　 Western Blot、RT-PCR結(jié)果顯示，耐藥細胞Panc1-GEM的mdr-1 在蛋白表達、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上比其親本細胞系Panc1增強，而脫氧胞苷激酶(dCK)基因在蛋白表達、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上比其親本細胞系Panc1 減弱。經(jīng)過RNA干擾耐GEM的胰腺癌細胞株AKT2表達

16、作用后，mdr-1 在蛋白表達、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上減弱，而脫氧胞苷激酶(dCK)基因在蛋白表達、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上增強。耐藥細胞Panc1-GEM對吉西他濱的IC50為239.82±35.47 μg/ml，耐藥系數(shù)（RI）為121.94；經(jīng)過RNA干擾耐GEM的胰腺癌細胞株AKT2表達作用后對吉西他濱的IC50為113.45±21.89 μg/ml，RI為57.88。
　　 結(jié)論：
　　 胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥的原因與