基于iTRAQ技術的結核性攣縮膀胱及狹窄輸尿管組織蛋白質組學研究及差異蛋白驗證.pdf

1、目的：
　　本研究通過蛋白質組學技術篩選正常膀胱組織與結核性攣縮膀胱組織、正常輸尿管組織與結核性狹窄輸尿管組織標本之間共有的差異蛋白，查閱文獻并從差異蛋白中篩選可能與膀胱及輸尿管纖維化病變發(fā)生、發(fā)展的相關蛋白，通過蛋白質免疫印跡技術進行差異蛋白驗證，為膀胱攣縮及輸尿管狹窄的分級、診斷、治療提供新的方法及靶點。
　　方法：
　　第一部分：收集2015年1月至2016年12月解放軍309醫(yī)院泌尿外科確診泌尿系結核患者的攣縮

2、膀胱及狹窄輸尿管組織各2塊；獲取我院同一時期DCD供者的膀胱及輸尿管組織各2塊作為正常對照。4種組織混合后用iTRAQ標記技術（相對和絕對定量同位素標記）聯(lián)合LC-MSMS(液相色譜串聯(lián)質譜)對各組的總蛋白進分析，將在正常膀胱與攣縮膀胱、正常輸尿管與狹窄輸尿管組織中表達差異在2倍及2倍以上的蛋白質定義為差異蛋白，并篩選2組之間共同表達的差異蛋白。通過Uniprot、DAVID、String、Wego數(shù)據(jù)庫對共有差異蛋白進行功能聚類、細胞

3、定位、相互作用分析。第二部分：分別選取上述4種組織各6塊，進行Masson染色，驗證攣縮膀胱、狹窄輸尿管組織膠原纖維的表達量；從共有的差異蛋白中挑選微纖絲相關糖蛋白4(MFAP4)和纖維調節(jié)素（FMOD）進行蛋白質免疫印跡（Western blot）驗證。
　　結果：
　　第一部分：通過蛋白質組學相關實驗，在正常膀胱組織與攣縮膀胱組織組共鑒定出188種差異蛋白質，正常輸尿管與狹窄輸尿管組共鑒定出130種差異蛋白質，2組所共有

4、的差異蛋白質48種，其中20種差異蛋白質下調，28種蛋白質表達上調；48種差異蛋白質在DAVID數(shù)據(jù)庫中共有28種蛋白質被標記，這28種蛋白質主要涉及17種生物學過程，5種分子功能途徑和13種細胞組成；48種蛋白質在String數(shù)據(jù)庫中，39種蛋白質被檢測到，共形成3條相互作用網(wǎng)絡。
　　第二部分：Masson染色提示在攣縮膀胱組織與狹窄輸尿管組織中，肌層可見大量膠原纖維表達，攣縮膀胱與正常膀胱、狹窄輸尿管與正常輸尿管相比，膠原纖

5、維表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義；western blot結果提示MFAP4、FMOD在攣縮膀胱及狹窄輸尿管中表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1、iTRAQ技術聯(lián)合LC-MSMS可對樣本蛋白進行定性、定量鑒定，篩選出差異蛋白，并對蛋白進行生物信息學分析；
　　2、纖維調節(jié)素蛋白(FMOD)在病變組織中表達上調，是影響膠原纖維合成的重要因素，與膀胱及輸尿管纖維化關系密切。
　　3、人微纖絲相關