泰和烏骨雞活性肽抗氧化與降血壓及其補血作用研究.pdf

1、泰和烏骨雞(Gallus gallus domesticus brisson)是江西省重要的特色藥食資源,既是一種營養(yǎng)豐富的滋補食品,又是特有藥用雞種,被歷代醫(yī)家沿用,歷史悠久,名揚中外。大量醫(yī)藥專著和文獻記載,烏骨雞具有補肝腎、益血氣、退虛熱、調經止帶等功能,還可醫(yī)治心腹痛、虛損、崩中帶下、遺精、消渴、久痢、骨折、腰酸腿痛、各種出血癥、紫癜、肝炎等疾病。因此,以泰和烏骨雞為原料生產的生物活性肽具有重要的研究價值。鑒于此,本論文以泰和烏

2、骨雞活性肽為研究對象,綜合運用食品科學、現(xiàn)代分離技術、天然產物化學、現(xiàn)代儀器分析、細胞和動物實驗等的一系列技術手段和研究方法,對其抗氧化活性、降血壓活性以及補血活性進行了較為全面和深入的研究,主要研究內容與結果如下:
　　 1、采用均勻設計優(yōu)化的木瓜蛋白酶酶解法制備泰和烏骨雞活性肽。該活性肽具有較強的O2·一、·OH、DPPH·、ABTS·+清除能力和還原能力,以及良好的Fe2+、Cu2+螯合能力和抑制脂質過氧化能力。利用制備型

3、RP-HPLC結合水作流動相,將泰和烏骨雞活性肽分離成四個組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),組分Ⅱ具有最強的O2·-、DPPH·清除能力和還原能力,以及較強的ABTS·+清除能力,其DPPH·、ABTS·+清除能力和還原能力強于相同濃度下的肌肽；組分Ⅰ具有最強的·OH清除能力。泰和烏骨雞活性肽富含Glu、Asp、Gly、Ala以及Leu等氨基酸,以及分子量在291-6070Da的小分子肽,這些因素是泰和烏骨雞活性肽具有較強的抗氧化活性的重要原因。

4、
　　 2、利用超濾分離得到<6kDa的泰和烏骨雞活性肽。該活性肽具有強烈的O2·-、ABTS·+清除能力和還原能力,以及良好的·OH、DPPH·清除能力、Fe2+、Cu2+螯合能力和抑制脂質過氧化能力。確定了0.01M磷酸鹽溶液(pH6.8)作為流動相的最佳分離條件,利用制備型RP-HPLC分離<6kDa的泰和烏骨雞活性肽,得到13個組分,對其采用強酸型離子交換樹脂結合強堿型離子交換樹脂進行脫鹽處理,得到較好的效果?？寡趸钚?/p>

5、測定表明,組分4具有強烈的還原能力；組分7具有最強的脂質過氧化抑制活性；組分8具有強烈O2·-、ABTS·+清除活性和還原能力；組分13具有最強DPPH·清除活性。采用RP-HPLC結合水-乙腈作流動相,梯度洗脫分離組分4、8,分別得到4個亞組分?？寡趸钚詼y定表明,組分4-3具有最強的還原能力；組分8-3具有最強的O2·-、ABTS·+清除能力和還原能力,且強于相同濃度下的肌肽。組分8-3純度較高,HPLC-ESI+-MS／MS鑒定出

6、其序列為Glu-Pro—Asp-Arg-Tyr。
　　 3、從豬肺中提取ACE,其酶活力為27U／mL。建立RP-HPLC結合水(0.1％甲酸)-乙腈法,測定了泰和烏骨雞活性肽的ACE抑制活性。采用體外模擬胃腸道消化法對泰和烏骨雞肉進行酶解,隨著消化時間的增加,不同階段消化液水解度增大,小分子肽含量增加,ACE抑制活性保持在57.8％以上。首先采用超濾分離360min腸道消化液,得到<3kDa泰和烏骨雞活性肽,其ACE抑制IC5

7、0為0.56mg／mL；其次采用制備型RP-HPLC分離<3kDa活性肽,得到3個分離組分,組分F2的ACE抑制活性最強,IC50為0.21mg／mL；最后采用凝膠柱色譜分離F2得到2個分離組分,組分F2-2的ACE抑制活性最強,IC50為0.04mg／mL。利用HPLC／Q-TOF MS從F2-2中鑒定出一種新型的ACE抑制肽,其序列為Glu-Pro-Leu-Tyr-Tyr。
　　 4、采用細胞和動物實驗對泰和烏骨雞活性肽及其

8、分離組分的補血活性進行評價。泰和烏骨雞活性肽具有促進正常小鼠骨髓有核細胞增殖的作用,其分離組分7、8、9、10可極顯著(P<0.01)促進小鼠骨髓有核細胞增殖,濃度為0.1μg／mL時,增殖率可達130％以上。采用RP-HPLC結合DNFB柱前衍生法測得組分7、8、9、10的氨基酸組成,它們主要含有Tyr、Gly、Glu、Asp以及Ala等氨基酸,可推測該5種氨基酸為刺激小鼠骨髓有核細胞增殖活性成分的物質基礎。泰和烏骨雞活性肽可升高失血

9、性血虛小鼠的胸腺和脾臟指數(shù),增強血虛小鼠免疫功能,促進機體快速造血。該活性肽還可顯著升高失血性血虛小鼠RBC值(P<0.05):可使5-氟尿嘧啶致血虛小鼠RBC、HOB、HCT值快速恢復到正常水平；可顯著升高失血、5-氟尿嘧啶共同致血虛小鼠RBC值(P<0.05),使HGB值快速恢復到正常水平。泰和烏骨雞活性肽組分8可使失血、5-氟尿嘧啶共同致血虛小鼠HGB值快速恢復到正常水平,并能快速升高血虛小鼠RBC、HCT值。動物實驗結果明確表明