真核起始因子6(eIF6)在皮膚肌成纖維細胞分化中的作用及機制研究.pdf

1、背景:真核起始因子6(Eukaryotic initiation factor6，eIF6)是一種在進化過程中的保守蛋白，eIF6通過調控核糖體40S和60S亞基的結合在核糖體合成及翻譯調控中發(fā)揮重要作用。eIF6被認為是翻譯起始的限速因子，可影響腫瘤發(fā)生及腫瘤生長。胞漿中eIF6活性受損可限制淋巴瘤生成及腫瘤進展。
　　目的:本研究的目的是探索eIF6是否能影響肌成纖維細胞的分化？這種作用是否通過調控TGF-β1的表達實現(xiàn)？eI

2、F6又是通過什么分子機制參與TGF-β1基因的表達調控？
　　第一部分 eIF6基因缺陷的雜合子小鼠皮膚肌成纖維細胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　方法:
　　1.分離新生eIF6+/-雜合子小鼠及野生型小鼠（日齡3天內(nèi)）真皮細胞進行原代培養(yǎng)(eIF6基因完全敲除的eIF6純合子小鼠胚胎在著床前即是致死性的)。本課題實驗中使用的是第1代至第3代的細胞。
　　2.應用免疫細胞化學方法檢測分離培養(yǎng)的真皮細胞中Vimentin及α

3、-SMA的表達。
　　3.應用逆轉錄PCR法對分離培養(yǎng)的真皮細胞進行基因型鑒定，區(qū)分來自eIF6+/-雜合子小鼠及野生型小鼠的細胞。
　　4.應用Real-Time PCR及Western blotting技術檢測eIF6+/-雜合子及野生型細胞中eIF6 mRNA及蛋白的表達。
　　結果:
　　1.成功分離培養(yǎng)了新生小鼠真皮肌成纖維細胞，細胞呈單層貼壁生長，呈典型的梭型及多角形形態(tài)，細胞體積較大。
　　2

4、.免疫細胞化學結果顯示Vimentin及α-SMA在體外培養(yǎng)的新生小鼠真皮胞漿中呈強陽性表達，陽性細胞率為100％。
　　3.逆轉錄PCR實驗結果顯示，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳僅顯示320bp一條帶的是來自于野生型小鼠的樣本，而顯示650bp及320bp兩條帶的是來自于eIF6基因表達缺陷的雜合子小鼠的樣本。
　　4.Western blotting實驗及Real-Time PCR實驗結果進一步確證，與野生型小鼠真皮來源的

5、肌成纖維細胞相比， eIF6 mRNA的表達在eIF6+/-雜合子小鼠的真皮肌成纖維細胞中降低了約40％，eIF6蛋白的表達在eIF6+/-雜合子小鼠的真皮肌成纖維細胞中降低了約60％。
　　第二部分 eIF6對皮膚肌成纖維細胞生物學特性及功能的影響
　　方法:
　　1.采用流式細胞技術檢測體外培養(yǎng)的來源于野生型及eIF6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細胞的細胞周期。
　　2.采用TUNEL法比較來源于野生型及eI

6、F6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細胞細胞凋亡的情況。
　　3.應用Real-Time PCR及Western blotting技術檢測eIF6+/-雜合子及野生型細胞中α-SMA mRNA及蛋白的表達;應用Real-Time PCR技術檢測eIF6+/-雜合子及野生型細胞中Ⅰ型膠原mRNA的表達;應用羅丹明-標記鬼筆環(huán)肽染色eIF6+/-雜合子及野生型細胞中的應力纖維并用激光共聚焦顯微鏡觀察應力纖維形成的情況;應用成纖維細胞凝膠收

7、縮模型觀察eIF6+/-雜合子及野生型細胞收縮膠原的能力。
　　結果:
　　1.采用流式細胞技術檢測體外培養(yǎng)的肌成纖維細胞的細胞周期，結果顯示:來源于eIF6基因缺陷雜合子小鼠的細胞處于S期的比例明顯低于來源于野生型小鼠的細胞(eIF6+/-雜合子細胞處于S期的比例為6.92％，而野生型細胞的比例為11.16％)。然而eIF6+/-雜合子細胞處于G2/M期的比例為42.13％，顯著高于野生型細胞(僅為27.59％)。

8、　　2.TUNEL法比較來源于野生型及eIF6+/-雜合子小鼠真皮肌成纖維細胞細胞凋亡的情況，兩組間凋亡細胞與有核細胞比例的差異無統(tǒng)計學意義
　　3.較野生型細胞相比，α-SMA在eIF6+/-雜合子細胞中的表達在mRNA水平及蛋白水平均顯著增高(mRNA表達增高2.9倍，P=0.020， n=5;蛋白表達增高1.8倍，P=0.029，n=5)。eIF6+/-雜合子細胞表達Ⅰ型膠原(Col1al and Col1a2) mRNA的

9、量也明顯高于野生型細胞中的表達量，Col1al mRNA表達增高4.9倍(P=0.001，n=3)，Col1a2mRNA表達增高4.6倍(P=0.007，n=3)。此外，激光共聚焦顯微鏡結果顯示:與野生型細胞相比，eIF6+/-雜合子細胞中羅丹明-標記鬼筆環(huán)肽染色的應力纖維形成增加，排列分布得更加密集。分析膠原收縮能力的成纖維細胞凝膠收縮模型發(fā)現(xiàn)，eIF6+/-雜合子細胞收縮膠原的能力強于野生型細胞(P=0.001，n=3)。
　

10、　第三部分 eIF6對皮膚肌成纖維細胞分化過程中信號轉導的影響
　　方法:
　　1.應用Real-Time PCR及Western blotting技術檢測eIF6+/-雜合子及野生型細胞中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達。
　　2.應用Real-Time PCR技術檢測eIF6+/-雜合子及野生型細胞中TGF-β1Ⅰ型受體(Tgfbr1)及TGF-β1Ⅱ型受體(Tgfbr2) mRNA的表達;應用Western b

11、lotting技術檢測在外源性TGF-β1刺激條件下，eIF6+/-雜合子及野生型細胞中Smad蛋白的表達。
　　3.應用Western blotting技術檢測在用SB431542阻斷TGF-β/Smad信號通路后，eIF6+/-雜合子及野生型細胞中p-Smad2及α-SMA蛋白的表達。
　　結果:
　　1.Real-Time PCR實驗結果顯示，TGF-β1(Tgfb1) mRNA在eIF6+/-雜合子細胞中的表達

12、顯著高于其在野生型細胞中的表達量，Tgfb1 mRNA表達增高2.7倍(P＜0.001，n=5)。ELISA實驗也發(fā)現(xiàn)eIF6+/-雜合子細胞分泌到培養(yǎng)上清中的TGF-β1也明顯增高（增高1.8倍，P＜0.001，n=5）。
　　2.Real-Time PCR實驗結果顯示，Tgfbr1及Tgfbr2 mRNA的表達在eIF6+/-雜合子細胞及野生型細胞中無顯著差異(P=NS，n=3)。Western blotting實驗結果顯示:

13、較野生型細胞相比，eIF6+/-雜合子細胞中p-Smad2蛋白的表達增高1.5倍(P=0.008，n=3)，與此同時抑制性Smad7蛋白的表達量在eIF6+/-雜合子細胞中降低50％(P=0.002，n=3)。eIF6+/-雜合子細胞中p-Smad3蛋白的表達也增高了，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P=NS，n=3）。
　　3.Western blotting實驗結果表明，SB431542處理可顯著抑制eIF6+/-雜合子細胞中p-Sm

14、ad2及α-SMA的增高，使其表達水平與在野生型細胞中表達量相當。
　　第四部分 eIF6通過影響TGF-β1轉錄調控皮膚肌成纖維細胞分化的機制探究
　　方法:
　　1.應用多核糖體譜實驗技術檢測TGF-β1 mRNA在野生型細胞組與eIF6+/-雜合子細胞中翻譯效率。
　　2.用放線菌素D(actinomycin D)預處理細胞旨在抑制細胞中新的mRNA的合成，并在處理后不同時間通過Real-Time PCR的

15、方法檢測細胞中原有mRNA隨時間降解的情況，比較TGF-β1 mRNA在野生型細胞組與eIF6+/-雜合子細胞中mRNA穩(wěn)定性差異。
　　3.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測肌成纖維細胞中TGF-β1啟動子區(qū)域甲基化程度。
　　4.應用定量蛋白組學iTRAQ技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation)篩選野生型

16、及eIF6基因表達缺陷的肌成纖維細胞中差異表達蛋白，并進行Westernblotting實驗驗證。
　　5.應用染色質免疫共沉淀(ChIP)技術檢測組蛋白變體H2A.Z和轉錄因子Sp1與TGF-β1基因啟動子區(qū)域的結合情況，并用Real-Time PCR方法對相同處理條件下TGF-β1 mRNA表達進行檢測。
　　結果:
　　1.多核糖體譜實驗發(fā)現(xiàn)，在含有質量大的多聚核糖體的餾分中TGF-β1 mRNA的含量在野生型細

17、胞組與eIF6+/-雜合子細胞組無顯著差異。
　　2.TGF-β1 mRNA在野生型細胞組與eIF6+/-雜合子細胞中的半衰期均為10.5h，兩組間TGF-β1 mRNA穩(wěn)定性并無差異。
　　3.BSP實驗結果顯示:在野生型細胞組TGF-β1啟動子甲基化比例為61.9％，在eIF6+/-雜合子細胞組TGF-β1啟動子甲基化比例為73.8％，二者差異無統(tǒng)計學意義
　　4.iTRAQ實驗發(fā)現(xiàn)302個與eIF6表達缺陷相關的

18、差異表達蛋白。Go分析發(fā)現(xiàn)，eIF6表達缺陷導致表達下調的差異蛋白與染色體\染色質組裝、染色質聚集\解聚、DNA包裝、蛋白-DNA復合物聚集以及核小體聚集密切相關。其中，eIF6表達缺陷導致一些組蛋白的表達顯著降低。在這些差異表達的組蛋白中，變化程度最大的為Histonevariant H2A.Z（表達下降50％，P=4.30×10-11＜0.0001）以及Histone H2B（表達下降約40％，P=1.11×10-5＜0.0001）

19、。我們通過Western blotting實驗對部分差異表達蛋白進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)，較野生型細胞相比，組蛋白H2B及組蛋白變體H2A.Z在eIF6+/-雜合子細胞中的表達顯著降低，H2B蛋白表達降低了45％，H2A.Z蛋白降低了40％(P=0.051，n=3)，該結果與定量蛋白質組學結果一致。此外，我還通過Real-Time PCR技術檢測了eIF6+/-雜合子細胞中的H2A.Z(H2afz) mRNA的表達，H2afz mRNA表達較

20、野生型細胞中降低了20％(P=0.015，n=3)
　　5.ChIP-qPCR實驗結果顯示，經(jīng)外源性TGF-β1預處理的野生型細胞及eIF6+/-雜合子細胞，在eIF6+/-雜合子細胞中H2A.Z與TGF-β1啟動子相應區(qū)域的結合較野生型細胞相比顯著降低，而此時在野生型細胞中TGF-β1啟動子相應區(qū)域有大量的H2A.Z蛋白的結合(相應結合區(qū)域為區(qū)域1:-120/+73;區(qū)域2:-37/+175;區(qū)域3:-118/+246)。此外，

21、ChIP-qPCR實驗結果也顯示:eIF6+/-雜合子細胞中Sp1結合TGF-β1啟動子的量顯著高于其在野生型細胞中的結合量，并且結合區(qū)域包含所有Sp1在TGF-β1啟動子上的預期結合位點。與此同時，在外源性TGF-β1刺激的條件下TGF-β1誘導自身mRNA表達量在eIF6+/-雜合子細胞中顯著增高，是野生型細胞表達量的3.4倍(P=0.001，n=5)。
　　結論:
　　1.eIF6參與調控肌成纖維細胞的分化，eIF6表

22、達缺陷誘導肌成纖維細胞分化，促進肌成纖維細胞表達α-SMA、合成膠原及增強細胞收縮膠原的能力。
　　2.eIF6負性調控肌成纖維細胞中TGF-β1的表達，并且該調控作用主要發(fā)生在轉錄層面。
　　3.eIF6表達缺陷通過下調組蛋白變體H2A.Z對TGF-β1啟動子的結合，可能通過增加染色質的空間可接近性，從而促進轉錄因子Sp1對TGF-β1啟動子的結合，導致TGF-β1轉錄活性增強。
　　4.TGF-β/Smad信號通路