間質(zhì)成纖維細(xì)胞在食管癌變進(jìn)程中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，5年生存率低，浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者死亡及預(yù)后的重要因素。食管癌具體發(fā)生機(jī)制尚不明確，以往關(guān)于食管癌的研究多專注于惡變的鱗狀上皮細(xì)胞，而很少關(guān)注上皮細(xì)胞周圍的間質(zhì)微環(huán)境，近年來，腫瘤間質(zhì)微環(huán)境的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)?；罨陌┫嚓P(guān)纖維母細(xì)胞(Cancer-associated fibroblasts CAFs)

2、是腫瘤間質(zhì)微環(huán)境內(nèi)的主要效應(yīng)細(xì)胞，研究證實(shí)，包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤組織內(nèi)的癌相關(guān)纖維母細(xì)胞，與正常成纖維細(xì)胞相比，在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長方式、增殖活性、運(yùn)動(dòng)能力等發(fā)面均發(fā)生了顯著變化，并且能夠分泌大量的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生的信號(hào)分子以介導(dǎo)上皮-間質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用。
　　目的:
　　食管癌的發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)的過程，從正常鱗狀上皮發(fā)展到鱗狀細(xì)胞癌的過程中存在中間過渡階段—不典型增生鱗狀上皮或異型增生鱗狀上皮，此種上皮與正常鱗

3、狀上皮和癌上皮細(xì)胞有著不同的結(jié)構(gòu)與功能，在癌前病變間質(zhì)組織中，是否也存在正常成纖維細(xì)胞向癌相關(guān)纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過渡階段-不典型增生間質(zhì)成纖維細(xì)胞尚不知曉，與正常成纖維細(xì)胞和癌相關(guān)纖維母細(xì)胞相比，其結(jié)構(gòu)和功能特性又會(huì)有何不同，在食管癌變進(jìn)展中起到何種作用，具體作用機(jī)制如何，均有待研究證實(shí)。食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞在食管癌變進(jìn)程中扮演何種角色，深入研究其具體作用機(jī)制可能有助于食管癌及食管癌前病變的早期診斷，早期治療，為食管癌及食管癌前病變的藥物治

4、療提供作用靶點(diǎn)。
　　方法:
　　研究食管癌變過程中間質(zhì)成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變規(guī)律及間質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，采用免疫組織化學(xué)方法檢測食管正常組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組及進(jìn)展期癌組間質(zhì)和上皮組織中α-SMA、TGFβ1、smad4、HGF、c-met、MMP2、MMP9及VEGF表達(dá)變化，計(jì)數(shù)各組微血管密度，統(tǒng)計(jì)分析各組指標(biāo)與病變的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)分析間質(zhì)表達(dá)α-SMA與TGFβ1、HGF的相關(guān)性

5、，統(tǒng)計(jì)分析間質(zhì)TGFβ1與上皮smad4，間質(zhì)HGF與上皮c-met的表達(dá)相關(guān)性;體外分離培養(yǎng)人食管不同病變階段組織中的間質(zhì)成纖維細(xì)胞，包括食管正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs）、食管不典型增生成纖維細(xì)(atypical hyperplasiafibroblasts，AFs)、食管癌相關(guān)纖維母細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)，觀察三種間質(zhì)成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，檢測

6、各自的免疫表型和生物學(xué)特性，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)變化，組織塊貼壁法和酶消化法體外培養(yǎng)三種食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞，采用倒置相差顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞大體形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，瑞氏-吉姆薩染色方法，觀察細(xì)胞著色情況，細(xì)胞免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測細(xì)胞表面蛋白，包括角蛋白(cytokeratin，CK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)的表達(dá)情況，采用四氮唑藍(lán)比色法繪制

7、NFs，AFs及CAFs7天生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測NFs，AFs及CAFs細(xì)胞周期，RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)α-SMA、TGFβ1、HGF、MMP2、MMP9及VEGF-A的基因表達(dá)，Transwell技術(shù)檢測癌細(xì)胞分別與三種間質(zhì)成纖維細(xì)胞間接接觸前后，4種細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)變化，同時(shí)檢測癌細(xì)胞對間質(zhì)成纖維細(xì)胞侵襲力的影響;體外模擬微環(huán)境分析三種間質(zhì)成纖維細(xì)胞與癌細(xì)胞體外間接接觸作用機(jī)制，建立動(dòng)物模型，體內(nèi)研究三種間質(zhì)成纖維細(xì)胞與癌細(xì)

8、胞直接接觸作用機(jī)制。將癌細(xì)胞株分別與三種食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞混合注射于裸鼠皮下，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察成瘤時(shí)間、成瘤率以及腫瘤增長速度，免疫組化檢測間質(zhì)成纖維細(xì)胞的表型變化，PCNA蛋白染色檢測食管癌細(xì)胞的增殖能力變化，CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞以檢測腫瘤間質(zhì)微血管密度。
　　結(jié)果:
　　第一部分:隨食管癌變進(jìn)展，食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生了轉(zhuǎn)變，由α-SMA陰性表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃员磉_(dá)，且呈逐漸增高趨勢;間質(zhì)和上皮中TGFβ1、H

9、GF、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)均逐漸上升，上皮中c-met蛋白表達(dá)亦呈逐漸上升趨勢，而smad4蛋白表達(dá)呈下降趨勢，間質(zhì)中VEGF蛋白表達(dá)逐漸升高。在間質(zhì)成纖維細(xì)胞中α-SMA與TGFβ1、HGF表達(dá)呈正相關(guān)。隨食管癌變進(jìn)展，MVD值逐漸增高，MVD值與TGFβ1、HGF和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)。
　　第二部分:體外成功培養(yǎng)出食管正常成纖維細(xì)胞、不典型增生成纖維細(xì)胞和癌相關(guān)纖維母細(xì)胞，純化后的細(xì)胞純度達(dá)到95％。光鏡下觀察，三種間

10、質(zhì)成纖維細(xì)胞呈扁平長梭形，大小基本一致，突觸較多，食管正常成纖維細(xì)胞間存在密度抑制和接觸抑制，而不典型增生成纖維細(xì)胞和癌相關(guān)纖維母細(xì)胞抑制和接觸抑制消失，細(xì)胞排列紊亂，局部出現(xiàn)重疊生長的現(xiàn)象;電鏡下觀察，食管三種成纖維細(xì)胞富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基體，食管正常成纖維細(xì)胞內(nèi)可見微絲，不典型增生成纖維細(xì)胞和癌相關(guān)纖維母細(xì)胞內(nèi)可見大量微絲，局部形成微絲束，甚至成團(tuán)形成致密斑。三種間質(zhì)成纖維細(xì)胞角蛋白染色均為陰性，波形蛋白染色均為陽性，食管

11、正常成纖維細(xì)胞的α-SMA染色為陰性，食管不典型增生成纖維細(xì)胞和癌相關(guān)纖維母細(xì)胞α-SMA表達(dá)均為陽性。NFs、AFs和CAFs生長曲線均為S形，3-5d為對數(shù)生長期，細(xì)胞生長旺盛，CAFs是活化的成纖維細(xì)胞，增殖能力明顯強(qiáng)于NFs和AFs，AFs增殖能力則介于NFs和CAFs之間，接近于CAFs。NFs，AFs，CAFs組處于S期細(xì)胞百分比分別為23.7，32.8，33.4。
　　第三部分:從NFs→AFs→CAFs，Vimen

12、tin mRNA的表達(dá)無變化，α-SMA mRNA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，TGFβ1，HGF，MMP2，MMP9 mRNA在NFs、AFs、CAFs中表達(dá)水平依次增高。 VEGF-A在NFs未見表達(dá)，在AFs、CAFs中高表達(dá)。三種食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞分別與食管癌細(xì)胞ECa109間接共培養(yǎng)后，TGFβ1，HGF，MMP2，MMP9均表達(dá)增強(qiáng)。NFs對ECa109無明顯促進(jìn)增殖作用，而AFs、CAFs刺激食管癌細(xì)胞株ECa109細(xì)胞內(nèi)PCNA表達(dá)量

13、顯著增加，促進(jìn)ECa109的增殖。侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白對照組中僅有少量食管癌細(xì)胞穿透Matrigel，到達(dá)濾膜下方的細(xì)胞數(shù)為（18.0±5.4）個(gè)，NFs組到達(dá)濾膜下方的細(xì)胞數(shù)為(35.0±4)個(gè)，AFs和CAFs作用下濾膜下方的細(xì)胞數(shù)分別為(125.2±7.1)、(135.5±8)個(gè)。動(dòng)物模型結(jié)果顯示，食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞與癌細(xì)胞株混合注射可明顯縮短成瘤時(shí)間，提高成瘤率，腫瘤內(nèi)微血管密度增加，從而加速腫瘤的生長。
　　結(jié)論:

14、　　1、在食管癌變進(jìn)程中，食管正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞與癌相關(guān)纖維母細(xì)胞間存在中間過渡階段-食管不典型增生成纖維細(xì)胞。從正常成纖維細(xì)胞→不典型增生成纖維細(xì)胞→癌相關(guān)纖維母細(xì)胞，其免疫表型逐步發(fā)生了改變。
　　2、體外可成功培養(yǎng)三種食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞。從正常成纖維細(xì)胞→不典型增生成纖維細(xì)胞→癌相關(guān)纖維母細(xì)胞，細(xì)胞功能越發(fā)活躍，生物學(xué)特性發(fā)生了改變，處于增殖期細(xì)胞比例增高。
　　3、癌細(xì)胞可通過旁分泌細(xì)胞因子，間接刺激食管間質(zhì)成纖維細(xì)