Ochrobactrum intermedium DN2煙堿降解酶的分離純化及酶產(chǎn)量的優(yōu)化研究.pdf

1、從降低煙草行業(yè)成本和減少環(huán)境污染的角度出發(fā)，降解上部煙葉和煙草廢棄物中的煙堿已成為煙草行業(yè)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本論文分離和純化了一株新型的煙堿降解細(xì)菌中間蒼白桿菌（Ochrobacterum intermedium）DN2所產(chǎn)的煙堿降解酶，對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件提高了酶產(chǎn)量。此外，還對(duì)煙堿降解酶在煙草薄片液中的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究。論文的主要內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　 煙堿降解酶粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀，凝膠過(guò)濾

2、層析和離子交換柱層析分離純化，得到了電泳純的煙堿降解酶。分離純化過(guò)程中酶被提純了35.24倍，酶活回收率為6.4％。煙堿降解酶的分子量為40.06kDa。其最適反應(yīng)pH為6.0，在pH5.0-8.0范圍內(nèi)都很穩(wěn)定。煙堿脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，50℃下酶活力較穩(wěn)定，保溫2.5h后仍有80％以上酶活，在溫度超過(guò)60℃后酶活下降較快。EDTA和Na2MoO4對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用，CoCl2、MnCl2對(duì)酶活抑制作用較顯著。酶的Km為0

3、.13mmol/L。
　　 采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，對(duì)影響0.intermedium DN2產(chǎn)煙堿降解酶的20個(gè)因素進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明：影響該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的顯著因子為：煙堿、酵母膏、葡萄糖、Tween-80、初始pH、接種量、裝液量和培養(yǎng)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法分別對(duì)影響該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。得到上述各顯著因子的最佳水平為：煙堿2.183g/L、葡萄糖0.823 g/L、酵母膏0

4、.844 g/L、Tween-800.976g/L、初始pH6.9、接種量8.6％、裝液量413ml/1L三角瓶、培養(yǎng)時(shí)間32h。在此優(yōu)化條件下得到實(shí)際酶活為9412U/L，與預(yù)測(cè)值9625U/L相近。
　　 實(shí)驗(yàn)確定利用煙堿降解酶降解煙草薄片液中的煙堿的最適反應(yīng)條件為：煙堿含量1.21g/L，粗酶含量6％，pH7.0，45℃下反應(yīng)，添加EDTA至終濃度為1mM/L。在此最適條件下，12h的煙堿降解率達(dá)到88％，薄片液中的煙堿濃