敲低錨定重復(fù)區(qū)域1(Ankrd1)通過抑制p53活化和線粒體功能障礙減少心肌細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究目的:
　　本研究主要目的在于以AngⅡ刺激及主動(dòng)脈弓縮窄(TAC)手術(shù)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并通過腺相關(guān)病毒基因調(diào)控技術(shù)探討:(1)敲低Ankrd1對(duì)血管緊張素Ⅱ刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響;(2) Ankrd1是否調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞p53活性和線粒體功能紊亂;(3)敲低Ankrd1對(duì)左室壓力負(fù)荷所致心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究方法:
　　1.乳鼠心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)和刺激
　　分離SD大鼠乳鼠（出生1-

2、3天內(nèi)）心肌細(xì)胞，培養(yǎng)96小時(shí)后加入1μM血管緊張素Ⅱ或攜帶Ankrd1靶向shRNA的腺相關(guān)病毒(AAV-shAnkrd1)或陰性對(duì)照（AAV-ZsGreen）。采用MTT和Hoechst的方法分別檢測心肌細(xì)胞存活率和心肌細(xì)胞凋亡。提取心肌細(xì)胞總蛋白或線粒體蛋白采用Western Blot的方法檢測CARP、p53、磷酸化p53(p-p53)和Bax等蛋白表達(dá)水平，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。
　　2.左心室壓力負(fù)荷模型

3、制備及處理
　　8-10周齡C57BL/6雄性小鼠，體重約22-25g，戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，氣管插管，開胸，按照之前文獻(xiàn)中介紹的方法行主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)(TAC)制備左室壓力負(fù)荷模型。手術(shù)4周后取心臟組織，提取組織總蛋白后采用WesternBlot的方法檢測p53、p-p53和Bax蛋白表達(dá)水平;組織固定、脫水、浸蠟、包埋和切片后采用免疫組織化學(xué)方法檢測心肌組織Bax表達(dá)水平，采用Tunel染色檢測心肌細(xì)胞凋亡數(shù)

4、目，并進(jìn)行定量分析。
　　3.腺相關(guān)病毒制備和轉(zhuǎn)染
　　制備重組AAV2/9-CMV-ZsGreen-sh-Ankrd1和重組AAV2/9-CMV-ZsGreen陰性對(duì)照病毒。在離體水平，腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞（細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒數(shù)量為5×105vg/cell）96小時(shí)后通過細(xì)胞熒光和Western Blot檢測腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率及CARP蛋白表達(dá)水平。而在在體水平，4周齡C57小鼠腹腔麻醉、氣管插管和開胸后在小鼠心臟

5、左室游離壁直接注射AAV-sh-Ankrd1和陰性對(duì)照腺相關(guān)病毒病毒顆粒（共注射左心室前壁和心尖部兩個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)注射10ul，每只小鼠共計(jì)注射腺相關(guān)病毒量為1011vg），病毒轉(zhuǎn)染4周后取材通過冰凍切片觀察組織熒光和Western Blot檢測腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率及CARP蛋白表達(dá)水平，并行TAC手術(shù)或假手術(shù)。
　　4.線粒體膜電位檢測
　　線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mP

6、TP)開放，線粒體膜電位(MMP)會(huì)降低。為了檢測AngⅡ和轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒等不同刺激對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位所產(chǎn)生的影響，分別用TMRE（四甲基羅丹明已酯）和DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）標(biāo)記心肌細(xì)胞線粒體膜電位和細(xì)胞核，并在共聚焦顯微鏡(confocal)下觀察，通過紅色熒光的強(qiáng)弱變化評(píng)價(jià)不同刺激下心肌細(xì)胞線粒體膜電位的改變，間接反映心肌細(xì)胞凋亡情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±S

7、E）表示，統(tǒng)計(jì)顯著性差異分析采用t檢驗(yàn)或one-way或two-way ANOVA，多重比較采用Bonferroni's矯正。此外，變量的線性分析采用最小二乘法。本研究所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，P＜0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.心衰和AngⅡ刺激上調(diào)Ankrd1/CARP
　　Western Blot結(jié)果表明，C57小鼠TAC4周后以及SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞AngⅡ刺激24小時(shí)后，CARP蛋白表達(dá)水平明顯

8、增加。心房利鈉肽（ANP）和肺重體重比(LW/BW)是心衰的重要分子和形態(tài)學(xué)標(biāo)志，Ankrd1與ANP以及CARP與LW/BW相關(guān)性分析表明，兩者之間均存在正相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果說明心衰和AngⅡ刺激可上調(diào)Ankrd1/CARP。
　　2.腺相關(guān)病毒有效轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞和小鼠心臟組織
　　細(xì)胞熒光結(jié)果表明，AAV-shAnkrd1和AAV-ZsGreen腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，病毒轉(zhuǎn)染效率約為60％-70％，細(xì)胞蛋白West

9、em Blot也證實(shí)了轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1腺相關(guān)病毒之后，CARP蛋白水平與對(duì)照組和轉(zhuǎn)染AAV-ZsGreen組相比下降約70％。動(dòng)物水平腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞水平相似，組織熒光結(jié)果表明腺相關(guān)病毒注射4周后，腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率超過50％，組織蛋白Western Blot結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1病毒后CARP蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染AAV-ZsGreen下降約50％-60％。
　　3.敲低Ankrd1減少AngⅡ

10、誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡
　　MTT和Hoechst33258染色結(jié)果表明，AngⅡ刺激心肌細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞存活率降低，而凋亡細(xì)胞數(shù)目增加。但是，事先轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1腺相關(guān)病毒96小時(shí)后再加入AngⅡ刺激，與直接加入AngⅡ刺激相比，心肌細(xì)胞存活率增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。另外，單純轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1與對(duì)照組和轉(zhuǎn)染AAV-ZsGreen組相比，心肌細(xì)胞存活率與細(xì)胞凋亡數(shù)目均無明顯差異。上述結(jié)果說明

11、敲低Ankrd1不影響心肌細(xì)胞凋亡，但可部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　4.敲低Ankrd1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p53活化和Bax線粒體轉(zhuǎn)位
　　Western Blot結(jié)果表明，AngⅡ刺激心肌細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞p53和p-p53總蛋白表達(dá)水平增加，心肌細(xì)胞線粒體Bax蛋白表達(dá)水平增加，說明AngⅡ刺激心肌細(xì)胞p53活化和Bax線粒體轉(zhuǎn)位，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。同樣，事先轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd

12、1腺相關(guān)病毒96小時(shí)后再加入AngⅡ刺激與單純AngⅡ刺激相比，p-p53和線粒體Bax蛋白表達(dá)水平降低，但與對(duì)照組相比，這兩種蛋白表達(dá)水平無明顯差異，說明敲低Ankrd1不影響p53活化和Bax表達(dá)總量，但可部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)p53活化和Bax線粒體轉(zhuǎn)位的作用。
　　5.敲低Ankrd1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低
　　TMRE染色結(jié)果表明，AngⅡ刺激心肌細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組相比紅色熒光變?nèi)?，說明心肌細(xì)胞線粒

13、體膜電位下降，細(xì)胞凋亡增加，而事先轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1腺相關(guān)病毒的心肌細(xì)胞接受AngⅡ刺激后，線粒體膜電位下降程度較單純AngⅡ刺激明顯減少。但在無AngⅡ刺激時(shí)，單純轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1與對(duì)照組轉(zhuǎn)染AAV-ZsGreen相比，不影響線粒體膜電位。這些結(jié)果提示敲低Ankrd1可部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的作用。
　　6.敲低Ankrd1抑制壓力負(fù)荷小鼠心肌細(xì)胞凋亡
　　Western Blot結(jié)果表

14、明，C57小鼠壓力負(fù)荷2周后，與假手術(shù)組相比心臟組織總蛋白p53、p-p53和Bax表達(dá)水平均明顯增加，而事先心肌注射轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1腺相關(guān)病毒的小鼠壓力負(fù)荷2周后心臟組織上述三種蛋白表達(dá)水平雖較假手術(shù)組增加，但明顯較單純壓力負(fù)荷組減少;免疫組化結(jié)果表明，小鼠壓力負(fù)荷2周后，心肌組織Bax表達(dá)水平增加，而事先轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1腺相關(guān)病毒的小鼠壓力負(fù)荷2周后Bax增加明顯少于單純壓力負(fù)荷小鼠;另外，Tunel染色結(jié)果

15、表明小鼠壓力負(fù)荷2周后，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加，但是事先轉(zhuǎn)染AAV-shAnkrd1腺相關(guān)病毒的小鼠壓力負(fù)荷2周后心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目與單純壓力負(fù)荷小鼠相比明顯減少。上述在體實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果都說明了小鼠壓力負(fù)荷2周后，心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，但是，敲低Ankrd1可部分抑制左室壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　研究結(jié)論:
　　敲低Ankrd1可以部分抑制AngⅡ刺激和左室壓力負(fù)荷模型引起的心肌細(xì)胞凋亡，而這一作用可能是通過抑制p