肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中hdgf的表達(dá)機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　肝癌衍生生長(zhǎng)因子(hepatoma-derived growth factor HDGF)于1994年首先從人類(lèi)肝癌細(xì)胞株HuH-7無(wú)血清培養(yǎng)的上清液中分離得到的一種生長(zhǎng)因子，HDGF存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，胞質(zhì)中的HDGF能與mRNA形成復(fù)合物。肝癌，胃癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞肺癌，胰腺癌，食管癌細(xì)胞中的HDGF表達(dá)升高，細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的HDGF可以抑制細(xì)胞的凋亡。HDGF參與肝癌細(xì)胞的增殖、分化、遷移。有報(bào)道稱(chēng)在分析肝癌

2、患者肝癌細(xì)胞以及正常肝細(xì)胞的臨床病例時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞的HDGF表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞，且HDGF表達(dá)水平越高的患者生存期越短。此外HDGF參與核糖體的產(chǎn)生、RNA加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等機(jī)體正常發(fā)育過(guò)程，發(fā)揮促有絲分裂、促血管生、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用。
　　目前對(duì)HDGF的研究主要關(guān)注其功能，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道HDGF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，深入研究HDGF有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬從轉(zhuǎn)錄因子層面對(duì)HDGF的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方

3、法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肝正常細(xì)胞系L-02、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清），置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　二、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)篩選
　　用生物信息學(xué)軟件JASPAR和Alibaba2.1，預(yù)測(cè)可能與hdgf啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)預(yù)測(cè)出的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選，找出候選基因。
　　三、Realtime PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)
　

4、　Realtime PCR檢測(cè)L-02、HepG-2、SMMC-7721細(xì)胞系hsf1，hsf2，hsf4，hdgf及siRNA干擾前后轉(zhuǎn)錄因子hsf4，hdgf的mRNA表達(dá)情況。
　　四、siRNA干擾
　　hsf4的siRNA干擾片段干擾SMMC-7721細(xì)胞系。
　　五、Western blot
　　Realtime PCR檢測(cè)siRNA干擾SMMC-7721細(xì)胞系前后轉(zhuǎn)錄因子hsf4、hdgf的蛋白表達(dá)

5、情況。
　　六、ChIP-sequencing
　　應(yīng)用HSF4抗體對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系進(jìn)行ChIP-sequencing，獲取轉(zhuǎn)錄因子HSF4調(diào)控的基因表達(dá)譜。
　　七、結(jié)合位點(diǎn)篩選
　　ChIP-sequencing提供HSF4與hdgf擬結(jié)合區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，找出hdgf與HSF4結(jié)合區(qū)域。
　　八、對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用圖像采集分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)用均

6、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s）表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)
　　通過(guò)生物信息學(xué)軟件JASPAR和Alibaba2.1，預(yù)測(cè)出可以與hdgf啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，從中篩選出轉(zhuǎn)錄因子HSF。
　　二、檢測(cè)hsf與hdgf表達(dá)的相關(guān)性
　　我們對(duì)hsf家族的中hsf1、hsf2、

7、hsf4進(jìn)行Realtime PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)較肝正常細(xì)胞L-02，hsf4、hdgf在SMMC-7721細(xì)胞系中均表達(dá)升高，提示hsf4與hdgf表達(dá)的具有相關(guān)性。
　　三、siRNA干擾方法檢測(cè)HSF4對(duì)hdgf表達(dá)的調(diào)控作用
　　siRNA干擾SMMC-7721細(xì)胞系的hsf4表達(dá)，Realtime PCR、Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hdgf在SMMC-7721細(xì)胞系中表達(dá)降低，提示HSF4對(duì)hdgf表達(dá)有調(diào)控

8、作用。
　　四、ChIP-sequencing
　　免疫共沉淀法測(cè)序發(fā)現(xiàn)在hdgf啟動(dòng)子區(qū)染色體156721543-156718898區(qū)域有HSF4結(jié)合位點(diǎn)，總長(zhǎng)度為228bp。將生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出的9個(gè)dhgf與HSF4結(jié)合區(qū)域序列與該序列進(jìn)行比對(duì)，有三個(gè)預(yù)測(cè)序列在此區(qū)域，找到HSF4與hdgf啟動(dòng)子區(qū)擬結(jié)合區(qū)域，進(jìn)一步證明HSF4對(duì)hdgf表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)論：
　　初步證明人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721