肝癌細胞系SMMC-7721中hdgf的表達機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　肝癌衍生生長因子(hepatoma-derived growth factor HDGF)于1994年首先從人類肝癌細胞株HuH-7無血清培養(yǎng)的上清液中分離得到的一種生長因子，HDGF存在于細胞核和細胞質(zhì)中，胞質(zhì)中的HDGF能與mRNA形成復合物。肝癌，胃癌，結腸癌，非小細胞肺癌，胰腺癌，食管癌細胞中的HDGF表達升高，細胞內(nèi)高表達的HDGF可以抑制細胞的凋亡。HDGF參與肝癌細胞的增殖、分化、遷移。有報道稱在分析肝癌

2、患者肝癌細胞以及正常肝細胞的臨床病例時發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞的HDGF表達水平明顯高于正常肝細胞，且HDGF表達水平越高的患者生存期越短。此外HDGF參與核糖體的產(chǎn)生、RNA加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等機體正常發(fā)育過程，發(fā)揮促有絲分裂、促血管生、營養(yǎng)神經(jīng)的作用。
　　目前對HDGF的研究主要關注其功能，尚未見文獻報道HDGF的表達調(diào)控機制，深入研究HDGF有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，本實驗擬從轉(zhuǎn)錄因子層面對HDGF的調(diào)控機制進行研究。
　　方

3、法：
　　一、細胞培養(yǎng)
　　人肝正常細胞系L-02、人肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10％小牛血清），置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　二、轉(zhuǎn)錄因子預測篩選
　　用生物信息學軟件JASPAR和Alibaba2.1，預測可能與hdgf啟動子區(qū)結合的轉(zhuǎn)錄因子，對預測出的轉(zhuǎn)錄因子進行篩選，找出候選基因。
　　三、Realtime PCR檢測mRNA表達
　

4、　Realtime PCR檢測L-02、HepG-2、SMMC-7721細胞系hsf1，hsf2，hsf4，hdgf及siRNA干擾前后轉(zhuǎn)錄因子hsf4，hdgf的mRNA表達情況。
　　四、siRNA干擾
　　hsf4的siRNA干擾片段干擾SMMC-7721細胞系。
　　五、Western blot
　　Realtime PCR檢測siRNA干擾SMMC-7721細胞系前后轉(zhuǎn)錄因子hsf4、hdgf的蛋白表達

5、情況。
　　六、ChIP-sequencing
　　應用HSF4抗體對SMMC-7721細胞系進行ChIP-sequencing，獲取轉(zhuǎn)錄因子HSF4調(diào)控的基因表達譜。
　　七、結合位點篩選
　　ChIP-sequencing提供HSF4與hdgf擬結合區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子預測結果進行序列比對，找出hdgf與HSF4結合區(qū)域。
　　八、對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理
　　應用圖像采集分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)用均

6、數(shù)±標準差((x)±s）表示，應用統(tǒng)計軟件，用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　一、生物信息學軟件預測轉(zhuǎn)錄因子結合位點
　　通過生物信息學軟件JASPAR和Alibaba2.1，預測出可以與hdgf啟動子區(qū)相結合的轉(zhuǎn)錄因子，從中篩選出轉(zhuǎn)錄因子HSF。
　　二、檢測hsf與hdgf表達的相關性
　　我們對hsf家族的中hsf1、hsf2、

7、hsf4進行Realtime PCR檢測，發(fā)現(xiàn)較肝正常細胞L-02，hsf4、hdgf在SMMC-7721細胞系中均表達升高，提示hsf4與hdgf表達的具有相關性。
　　三、siRNA干擾方法檢測HSF4對hdgf表達的調(diào)控作用
　　siRNA干擾SMMC-7721細胞系的hsf4表達，Realtime PCR、Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)hdgf在SMMC-7721細胞系中表達降低，提示HSF4對hdgf表達有調(diào)控

8、作用。
　　四、ChIP-sequencing
　　免疫共沉淀法測序發(fā)現(xiàn)在hdgf啟動子區(qū)染色體156721543-156718898區(qū)域有HSF4結合位點，總長度為228bp。將生物信息學預測出的9個dhgf與HSF4結合區(qū)域序列與該序列進行比對，有三個預測序列在此區(qū)域，找到HSF4與hdgf啟動子區(qū)擬結合區(qū)域，進一步證明HSF4對hdgf表達的調(diào)控作用。
　　結論：
　　初步證明人肝癌細胞系SMMC-7721