c-Met阻斷劑抑制產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌胞內(nèi)感染機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是李斯特菌屬內(nèi)唯一對(duì)人類致病的菌種。在臨床治療中，盡管抗生素已經(jīng)有效地應(yīng)用于各種感染性疾病的治療，但是面對(duì)LM感染所導(dǎo)致的高致病率和高病死率，我們往往素手無(wú)策。LM對(duì)人體的感染多發(fā)生于免疫力低下的人群，如老年人、兒童、孕婦、長(zhǎng)期服用免疫抑制劑的病人及患有免疫系統(tǒng)疾病的人群等等。LM的感染多由于消化道感染引起，攝入被LM污染的

2、食物后，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌可粘附并侵襲腸道上皮細(xì)胞，其入侵腸道的重要毒力因子是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌表面的內(nèi)化素B(Internalin B，InlB)。
　　本文主要從以下幾個(gè)方面開展研究:(1)體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2 cells)及HBMECs，從而研究17-AAG和XL-184在阻止LM侵襲Caco-2細(xì)胞和HBMEC中所起的作用;(2)將Caco-2細(xì)胞和HBMEC接種于Transwell小室，并測(cè)量17-AA

3、G和XL-184孵育后單層細(xì)胞的跨膜電阻和滲透性，從而研究c-Met受體阻斷劑卡在保護(hù)細(xì)胞屏障的完整性中所扮演的角色;(3)體外培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞和HBMEC，并使用熒光染色技術(shù)(DAPI/PI)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放水平檢測(cè)技術(shù)，從而研究在17-AAG和XL-184的介入下，LM所致細(xì)胞凋亡率的變化情況。
　　方法：
　　1、檢測(cè)LM濃度并繪制LM與OD值的相關(guān)曲線
　　將LM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取100μl菌液

4、于離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速10000 rpm，去上清。將細(xì)菌沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液(即PBS)中。菌液濃度稀釋至1×10-1～-10并于紫外分光光度計(jì)600 nm處測(cè)量OD值。將各濃度的菌液取100 ul涂布于無(wú)抗生素的BHI固體平板上，37℃孵箱孵育24 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，并分析菌落數(shù)量、菌液各稀釋度與OD值之間的關(guān)系。
　　2、c-Met受體阻斷劑作用下LM生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
　　配制體積為5 ml分別含XL-184濃度為0、0.

5、05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10μM的BHI液體培養(yǎng)基，同時(shí)于培養(yǎng)基中加入100μl處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LM，37℃、200 rpm搖床中孵育LM。分別于0、2、4、6、8、10、12、14和16h取100μl菌液于96孔板中，酶標(biāo)儀600 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以A600處的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制LM生長(zhǎng)曲線。
　　3、研究LM對(duì)Caco-2和HBMEC的侵襲實(shí)驗(yàn)
　　人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco

6、-2及HBMEC體外培養(yǎng)于24孔板，待細(xì)胞匯合成單層（約105/孔）后進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法為:細(xì)胞單層加入無(wú)抗生素的培養(yǎng)基和LM(約107/孔，使細(xì)胞感染倍數(shù)為100)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min，無(wú)菌PBS洗三次，加入含慶大霉素100μg/ml的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞1h，達(dá)到抑制胞外細(xì)菌的作用。再用無(wú)菌PBS洗三遍，取100μl/孔0.5％TritonⅩ-100于24孔板，孵育8 min后，立即加入50μl蒸餾水中止Triton

7、Ⅹ-100的裂解作用。裂解液梯度稀釋(101-104)后涂板培養(yǎng)，24 h后計(jì)數(shù)并計(jì)算LM侵襲率。
　　4、c-Met受體阻斷劑單獨(dú)或與氨芐西林聯(lián)合作用下LM對(duì)Caco-2和HBMEC的侵襲實(shí)驗(yàn)
　　為了研究c-Met受體阻斷劑17-AAG和XL-184在阻止LM侵襲Caco-2和HBMEC中所起的作用，首先體外培養(yǎng)Caco-2和HBMEC于24孔板，待細(xì)胞匯合成單層（約105/孔）并形成緊密連接后，于不同的時(shí)間、不同濃度的

8、17-AAG和XL-184單獨(dú)或與氨芐西林(Ampicillin，AMP)聯(lián)合孵育Caco-2和HBMEC，孵育完畢后加入LM(約107/孔，使細(xì)胞感染倍數(shù)為100)，洗單層細(xì)胞三次并加入含有慶大霉素100μg/ml的培養(yǎng)基孵育1h，再次洗單層細(xì)胞三次后用0.5％ TritonⅩ-100裂解細(xì)胞，裂解液梯度稀釋(10-1-10-4)后涂板培養(yǎng)，24 h后計(jì)數(shù)并計(jì)算LM侵襲率。
　　5、c-Met受體阻斷劑作用下單層細(xì)胞通透性的檢測(cè)

9、
　　Caco-2和HBMEC接種于Transwell小室上層，生長(zhǎng)于聚碳酸酯膜的Caco-2或HBMEC，其細(xì)胞膜上的緊密連接結(jié)構(gòu)形成一道相對(duì)緊密的屏障以阻止小分子物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞單層，并可將transwell分為上下室，Caco-2和HBMEC可分別視為模擬血-腸屏障和血-腦屏障。接種Caco-2和HBMEC的上層小室分別加入含不同濃度XL-184的MEM培養(yǎng)基和含不同濃度的17-AAG的1640培養(yǎng)基，孵育24 h，無(wú)菌PBS洗

10、細(xì)胞三次，加入細(xì)菌(MOI=100)孵育1.5 h，隨后加入HRP3μg于37℃孵育。分別于0、2、4、6h從下層取30μl培養(yǎng)基涂布于不含抗生素的BHI固體平板，然后將培養(yǎng)基置于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中24 h后觀察并計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)量檢測(cè)下室MEM和1640培養(yǎng)基中HRP的濃度。電阻儀測(cè)量TEER值以觀察單層細(xì)胞通透性的改變情況。從下室取出培養(yǎng)基用于檢測(cè)后應(yīng)加入同等體積的無(wú)菌培養(yǎng)基，使得下室培養(yǎng)基體積始終保持為2ml

11、。
　　結(jié)果：
　　1、c-Met阻斷劑對(duì)體外LM生長(zhǎng)曲線無(wú)影響
　　在不同時(shí)間下，含不同濃度XL-184的BHI液體培養(yǎng)基中，LM的生長(zhǎng)情況無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，LM生長(zhǎng)曲線形狀相似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、致病菌LM對(duì)Caco-2細(xì)胞和HBMEC的侵襲率高于非致病菌DH5a、BL21(DE3)
　　對(duì)于Caco-2細(xì)胞:LM侵襲率約為0.168％，高于對(duì)照組DH5α的侵襲率0.019％(P=0.0

12、00)、高于BL21(DE3)的侵襲率0.023％(P=0.000)。
　　對(duì)于HBMEC:LM侵襲率約為0.129％，高于對(duì)照組DH5α的侵襲率0.024％(P=0.000)、高于BL21(DE3)的侵襲率0.027％(P=0.000)。
　　3、c-Met阻斷劑可降低LM對(duì)于Caco-2細(xì)胞及HBMEC的侵襲率
　　藥物組侵襲率均低于對(duì)照組(P=0.000)。隨XL-184濃度升高，LM對(duì)Caco-2、HBMEC的

13、侵襲率降低。相同劑量藥物作用下，XL-184孵育Caco-2細(xì)胞1，2，6，12h即可降低LM的侵襲率。XL-184孵育HBMEC1，2，6h即可降低LM的侵襲率。隨17-AAG濃度增高，LM對(duì)Caco-2的侵襲率有下降趨勢(shì)。17-AAG孵育細(xì)胞1h即可明顯降低LM對(duì)Caco-2的侵襲。
　　4、XL-184與AMP聯(lián)合用藥對(duì)于抑制LM侵襲Caco-2、HBMEC的效果優(yōu)于XL-184單獨(dú)用藥
　　各濃度XL-184分別與5

14、0μg/ml AMP共孵育Caco-2細(xì)胞24 h;實(shí)驗(yàn)組LM對(duì)Caco-2的侵襲率低于對(duì)照組(P0～1＜0.01，P5＜0.05);隨XL-184劑量增大，LM對(duì)Caco-2的侵襲率有下降趨勢(shì)。
　　各濃度Amp分別與0.1μM XL-184共孵育Caco-2細(xì)胞24 h;實(shí)驗(yàn)組LM對(duì)細(xì)胞的侵襲率均低于對(duì)照組(P＜0.01);且隨氨芐西林劑量增大，LM對(duì)Caco-2的侵襲率有下降趨勢(shì)。
　　各濃度XL-184分別與50μg

15、/ml氨芐西林共孵育HBMEC24 h，實(shí)驗(yàn)組LM對(duì)細(xì)胞的侵襲率低于對(duì)照組(P=0.000);隨XL-184劑量增大，LM對(duì)HBMEC的侵襲率有下降趨勢(shì)。
　　各濃度Amp分別與0.1μM XL-184共孵育細(xì)胞24 h，實(shí)驗(yàn)組LM對(duì)細(xì)胞的侵襲率均低于對(duì)照組（P=0.000）;隨氨芐西林劑量增大，LM對(duì)HBMEC的侵襲率有下降趨勢(shì)。
　　5、17-AAG與氨芐西林聯(lián)合用藥對(duì)于抑制LM侵襲Caco-2的效果優(yōu)于17-AAG單獨(dú)

16、用藥
　　各濃度17-AAG分別與50μg/ml Amp共孵育細(xì)胞24 h，實(shí)驗(yàn)組LM對(duì)Caco-2的侵襲率低于對(duì)照組(P0=0.000，P50～100＜0.05，P250～500＜0.01);隨17-AAG劑量增大，LM對(duì)Caco-2的侵襲率有下降趨勢(shì)。
　　各濃度AMP分別與50 nM17-AAG共孵育細(xì)胞24 h，實(shí)驗(yàn)組LM對(duì)Caco-2的侵襲率低于對(duì)照組(P0=0.000，P5＜0.01，P25～50＜0.05，P1

17、00＞0.05);且隨藥物劑量增大，LM對(duì)Caco-2的侵襲率有下降趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1、c-Met阻斷劑在體外不能抑制LM的生長(zhǎng)。
　　2、c-Met阻斷劑可降低LM對(duì)于細(xì)胞的侵襲。
　　3、c-Met阻斷劑與青霉素類抗生素聯(lián)合應(yīng)用可有效降低LM對(duì)于細(xì)胞的侵襲。
　　4、c-Met阻斷劑通過(guò)降低LM對(duì)于細(xì)胞的侵襲進(jìn)而抑制LM對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的有害作用。
　　5、c-Met阻斷劑通過(guò)降低LM介導(dǎo)的有