syk、JNK調(diào)控單核細(xì)胞增生李斯特菌感染過程中炎癥復(fù)合體活化機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　探討脾源性酪氨酸激酶syk信號通路以及胞內(nèi)其它常見蛋白激酶（如JNK，P38MAPK以及PI3K等）信號通路在單增李斯特菌(LM)感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞過程中對炎癥復(fù)合體活化與裝配的作用。
　　方法:
　　將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為BAY處理組、SP處理組、SB處理組、WO處理組、未處理組以及陰性對照組(NI)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。BAY處理組、SP處理組、SB處理組、WO處理組分別用syk抑制劑BAY11708

2、2，JNK抑制劑SP600125，P38MAPK抑制劑SB203580以及PI3K抑制劑wotamine預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞1h，除陰性對照組外，其余各組巨噬細(xì)胞感染野生型LM(WT-LM)24 h，ELISA檢測上清液中白細(xì)胞介素(IL)-18表達(dá)水平;免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)炎癥復(fù)合體的關(guān)鍵蛋白組分細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白ASC斑點(diǎn)(ASC-speck)的形成情況;Westernblot檢測WT-LM感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞不同時(shí)相點(diǎn)蛋白syk以及

3、JNK的磷酸化水平變化情況，同時(shí)使用LM的△hly和△hly∷hly突變株感染細(xì)胞觀察syk以及JNK蛋白的磷酸化水平變化。同時(shí)利用NLRP3炎癥復(fù)合體的特異刺激物(ATP)刺激BAY處理組與SP處理組巨噬細(xì)胞3h，ELISA檢測上清液中IL-18的水平;免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)ASC-speck的形成情況;使用AIM2炎癥復(fù)合體特異刺激物(Poly(dA:dT))及IPAF炎癥復(fù)合體特異刺激物(鞭毛蛋白-flagellin)分別刺激SP處理

4、組細(xì)胞，ELISA檢測上清液中IL-18的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　BAY處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞感染LM后IL-18的表達(dá)水平與未處理組相比明顯降低(P＜0.05)，其它幾種蛋白激酶抑制劑處理組中，只有SP處理組IL-18的表達(dá)水平與未處理組相比明顯降低（P＜0.05），而且降低的程度與BAY處理組相似，而SB處理組和WO處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的IL-18表達(dá)水平與未處理組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），免疫熒光

5、結(jié)果顯示BAY處理組與SP處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LM刺激后，胞內(nèi)ASC-speck陽性的細(xì)胞百分比均明顯低于未處理組(P＜0.01)。Western blot結(jié)果表明野生型LM感染過程中JNK的磷酸化水平10min時(shí)明顯升高，在40min時(shí)達(dá)到最高水平，持續(xù)至少120min，同時(shí)syk的磷酸化水平在感染5min即可被檢測到，進(jìn)一步證實(shí)syk與JNK在LM感染過程中發(fā)揮著重要的作用。LM的△hly和△hly∷hly突變株感染巨噬細(xì)胞過程

6、中，JNK蛋白的磷酸化水平在△hly突變株感染后40min仍有顯著表達(dá)，但在80min和120min出現(xiàn)驟然減弱，而syk磷酸化水平表達(dá)趨勢發(fā)生變化，野生型LM和△hly:hly-LM感染組，p-syk的表達(dá)高峰均出現(xiàn)在感染后15min，在30min時(shí)表達(dá)量均減少，而△hly-LM感染組p-syk的表達(dá)高峰與野生型LM組p-syk的表達(dá)高峰相比，出現(xiàn)高峰延遲，高峰時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)在感染后30min時(shí)，結(jié)果表明，syk與JNK信號通路在調(diào)節(jié)LM

7、感染后炎癥復(fù)合體的過程中，LM的主要毒力因子LLO可能是其重要的調(diào)控靶點(diǎn)。為進(jìn)一步探究JNK和syk信號通路是否特異性的促進(jìn)LM感染過程中炎癥復(fù)合體的活化，ATP刺激BAY處理組及SP處理組后發(fā)現(xiàn)，只有SP處理組的IL-18表達(dá)水平及胞內(nèi)ASC-spek的百分比數(shù)量與未處理組相比明顯降低(P＜0.05)，而BAY處理組的IL-18表達(dá)水平與未處理組相比無明顯變化;Poly(dA:dT)及鞭毛蛋白分別刺激SP處理組后，結(jié)果顯示Poly(d

8、A:dT)刺激實(shí)驗(yàn)中，SP處理組的IL-18表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，而鞭毛蛋白刺激實(shí)驗(yàn)中的SP處理組IL-18水平與未處理組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，syk信號通路及JNK信號通路參與調(diào)控單增李斯特菌感染過程中炎癥復(fù)合體的活化，而且在調(diào)節(jié)過程中，syk和JNK蛋白磷酸化變化水平與LLO密切相關(guān)。而且，syk信號通路特異性地調(diào)控LM感染中炎癥復(fù)合體的活化，而JNK信號通路可能非特異性參與NL