骨髓干細胞移植治療大鼠糖尿病足促進血管新生的初步實驗研究.pdf

1、目的:建立一種簡單的、穩(wěn)定的大鼠糖尿病足模型，應(yīng)用骨髓干細胞(bonemarrowstemcell，BMSC)移植治療大鼠糖尿病足，觀察其治療效果。應(yīng)用免疫組化技術(shù)評價治療后患肢局部肌肉組織微血管密度，并檢測血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialcellgrowthfactor，VEGF）表達水平;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-Polymerasechainreaction，RT-

2、PCR)技術(shù)檢測血管生成素Ⅰ(angiopoietin，Ang-Ⅰ)表達水平。
　　 方法:1.健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分為實驗組(n=25)與對照組(n=5)，高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周。2.實驗組大鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)45mg/kg，對照組給予腹腔注射與實驗組同等劑量的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液;3天后測量空腹血糖，血糖≥16mmol/l為糖尿病模型造型成功。3.糖尿病成模大鼠予以行左下肢股動脈結(jié)扎術(shù)，建立糖

3、尿病足模型。4.常規(guī)取健康Wistar鼠股骨、脛骨骨髓血，應(yīng)用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞(bonemarrowmononuclearcell，BMMNC)。5.配制×106/mlBMMNC懸液以備用。6.將糖尿病足成模鼠8只隨機分為3組，組(n=6)為鼠模型非治療組;B組(n=6)為鼠模型治療組，予BMMNC懸液注射;C組(n=6)為鼠模型假治療組，予注射PBS液。7.監(jiān)測3組大鼠不同時間的空腹血糖、體重、飲水量以及尿量變化。于干

4、細胞局部移植治療28天后取缺血下肢局部肌肉組織，制作切片，行免疫組織化學染色，評價血管密度、檢測VEGF表達水平，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測Ang-Ⅰ在缺血患肢局部的表達水平。
　　 結(jié)果:1.25只實驗組大鼠注射STZ3天后，有19只大鼠空腹血糖≥16mmol/l，并有多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀;補注STZ7天后全部大鼠血糖≥16mmol/l。死亡4只。21只糖尿病成模鼠行左下肢股動脈結(jié)扎術(shù)6d后，5只死亡，余16只作為DF

5、鼠模型進入第2部分實驗，死亡4只，共12只完成實驗全過程。所有鼠模型股動脈結(jié)扎3天后，缺血后肢均逐漸出現(xiàn)不同程度的萎縮以及活動力下降。所有鼠模型在處死取材時，缺血后肢均無明顯壞疽出現(xiàn)。2.BMMNC患肢局部移植后免疫組化染色vWF計數(shù)微血管，A組4.667±0.577，B組7.25±0.5，C組4.3±0.819。B組微血管數(shù)量明顯高于A、C兩組，P＜0.05。3.BMMNC患肢局部移植后，患肢肌肉組織中VEGF蛋白表達量，A組123.

6、55±15.70，B組194.55±16.34，C組120.17±14.87。B組VEGF蛋白表達量高于A、C組，P＜0.05，具統(tǒng)計學意義。4.BMMNC患肢局部移植后，組織Ang-ImRNA提取質(zhì)量，A組0.482±0.017，B組1.173±0.028，C組0.474±0.016，B組值明顯高于A、C組，P＜0.05。
　　 結(jié)論:1.高糖高脂飲食4周可誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，同時合并給予小劑量STZ(45mg/kg)腹腔注射

7、，部分破壞胰島β細胞，此方法可誘導(dǎo)出與人類2型糖尿病接近的動物模型。糖尿病鼠行股動脈結(jié)扎術(shù)可以很好的模擬糖尿病足患者發(fā)病機制之一血管閉塞性缺血，但是不能完全反映出糖尿病足的多種因素共同作用的這一特點。2.BMMNC可通過采集骨髓血，密度梯度離心法獲得，行缺血局部肌肉組織移植后，可以穩(wěn)定歸巢到受損組織，參與缺血組織局部的血管重建過程，使缺血患肢的局部供血得到明顯改善。3.行BMMNC患肢局部移植后，缺血患肢局部肌肉組織中vWF計數(shù)明顯高于

8、對照組，其差異有統(tǒng)計學意義。4.行BMMNC局部移植治療后患肢局部肌肉組織的VEGF蛋白表達量明顯高于未行治療的對照組，差異有統(tǒng)計學意義。5.DF大鼠患肢局部BMMNC移植后局部肌肉組織中Ang-ⅠmRNA提取質(zhì)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。6.骨髓干細胞移(bonemarrowstemcelltransplant,BMSCT)治療DF的療效機制可能是:一方面，在移植治療后多種干細胞成分在歸巢至缺血組織局部分化成為血管內(nèi)皮細胞(e