骨髓干細(xì)胞移植治療大鼠糖尿病足促進(jìn)血管新生的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立一種簡(jiǎn)單的、穩(wěn)定的大鼠糖尿病足模型，應(yīng)用骨髓干細(xì)胞(bonemarrowstemcell，BMSC)移植治療大鼠糖尿病足，觀察其治療效果。應(yīng)用免疫組化技術(shù)評(píng)價(jià)治療后患肢局部肌肉組織微血管密度，并檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialcellgrowthfactor，VEGF）表達(dá)水平;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-Polymerasechainreaction，RT-

2、PCR)技術(shù)檢測(cè)血管生成素Ⅰ(angiopoietin，Ang-Ⅰ)表達(dá)水平。
　　 方法:1.健康雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=25)與對(duì)照組(n=5)，高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周。2.實(shí)驗(yàn)組大鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)45mg/kg，對(duì)照組給予腹腔注射與實(shí)驗(yàn)組同等劑量的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液;3天后測(cè)量空腹血糖，血糖≥16mmol/l為糖尿病模型造型成功。3.糖尿病成模大鼠予以行左下肢股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，建立糖

3、尿病足模型。4.常規(guī)取健康Wistar鼠股骨、脛骨骨髓血，應(yīng)用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bonemarrowmononuclearcell，BMMNC)。5.配制×106/mlBMMNC懸液以備用。6.將糖尿病足成模鼠8只隨機(jī)分為3組，組(n=6)為鼠模型非治療組;B組(n=6)為鼠模型治療組，予BMMNC懸液注射;C組(n=6)為鼠模型假治療組，予注射PBS液。7.監(jiān)測(cè)3組大鼠不同時(shí)間的空腹血糖、體重、飲水量以及尿量變化。于干

4、細(xì)胞局部移植治療28天后取缺血下肢局部肌肉組織，制作切片，行免疫組織化學(xué)染色，評(píng)價(jià)血管密度、檢測(cè)VEGF表達(dá)水平，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Ang-Ⅰ在缺血患肢局部的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:1.25只實(shí)驗(yàn)組大鼠注射STZ3天后，有19只大鼠空腹血糖≥16mmol/l，并有多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀;補(bǔ)注STZ7天后全部大鼠血糖≥16mmol/l。死亡4只。21只糖尿病成模鼠行左下肢股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)6d后，5只死亡，余16只作為DF

5、鼠模型進(jìn)入第2部分實(shí)驗(yàn)，死亡4只，共12只完成實(shí)驗(yàn)全過(guò)程。所有鼠模型股動(dòng)脈結(jié)扎3天后，缺血后肢均逐漸出現(xiàn)不同程度的萎縮以及活動(dòng)力下降。所有鼠模型在處死取材時(shí)，缺血后肢均無(wú)明顯壞疽出現(xiàn)。2.BMMNC患肢局部移植后免疫組化染色vWF計(jì)數(shù)微血管，A組4.667±0.577，B組7.25±0.5，C組4.3±0.819。B組微血管數(shù)量明顯高于A、C兩組，P＜0.05。3.BMMNC患肢局部移植后，患肢肌肉組織中VEGF蛋白表達(dá)量，A組123.

6、55±15.70，B組194.55±16.34，C組120.17±14.87。B組VEGF蛋白表達(dá)量高于A、C組，P＜0.05，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.BMMNC患肢局部移植后，組織Ang-ImRNA提取質(zhì)量，A組0.482±0.017，B組1.173±0.028，C組0.474±0.016，B組值明顯高于A、C組，P＜0.05。
　　 結(jié)論:1.高糖高脂飲食4周可誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，同時(shí)合并給予小劑量STZ(45mg/kg)腹腔注射

7、，部分破壞胰島β細(xì)胞，此方法可誘導(dǎo)出與人類(lèi)2型糖尿病接近的動(dòng)物模型。糖尿病鼠行股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)可以很好的模擬糖尿病足患者發(fā)病機(jī)制之一血管閉塞性缺血，但是不能完全反映出糖尿病足的多種因素共同作用的這一特點(diǎn)。2.BMMNC可通過(guò)采集骨髓血，密度梯度離心法獲得，行缺血局部肌肉組織移植后，可以穩(wěn)定歸巢到受損組織，參與缺血組織局部的血管重建過(guò)程，使缺血患肢的局部供血得到明顯改善。3.行BMMNC患肢局部移植后，缺血患肢局部肌肉組織中vWF計(jì)數(shù)明顯高于

8、對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.行BMMNC局部移植治療后患肢局部肌肉組織的VEGF蛋白表達(dá)量明顯高于未行治療的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.DF大鼠患肢局部BMMNC移植后局部肌肉組織中Ang-ⅠmRNA提取質(zhì)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.骨髓干細(xì)胞移(bonemarrowstemcelltransplant,BMSCT)治療DF的療效機(jī)制可能是:一方面，在移植治療后多種干細(xì)胞成分在歸巢至缺血組織局部分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞(e