通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)，通過(guò)高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)并結(jié)扎剪斷股動(dòng)、靜脈建立糖尿病足大鼠模型，觀察通心絡(luò)(TXL)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(Peripheral blood derived mesenchymal stem cells，PB-MSCs)治療后大鼠的血糖、血脂、下肢血管血流影像變化;通過(guò)觀察炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、晚期糖基化終末產(chǎn)物的變化及血管新生相關(guān)因子的表達(dá)，探討TXL聯(lián)合PB-MSCs移植治療糖尿病足促血

2、管新生的可能作用機(jī)制。通過(guò)上述研究以期為糖尿病足的治療提供新的治療方法。
　　方法:
　　1.脈絡(luò)學(xué)說(shuō)指導(dǎo)糖尿病足理論探討。
　　2.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足大鼠的作用研究。
　　3.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)糖尿病足大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及晚期糖基化終末產(chǎn)物的影響。
　　4.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足大鼠促血管新生的機(jī)制研究。
　　結(jié)果:
　　1.

3、通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足大鼠的作用研究
　　1.1.各組大鼠血糖、血脂、FINS、HOMA-IR及Ln(ISI)的變化。
　　1.2.各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血流差值比的變化。
　　1.3.各組大鼠下肢動(dòng)脈造影變化
　　正常組大鼠下肢動(dòng)脈造影血流通暢，血管顯示清晰，末端小動(dòng)脈顯影清晰。與對(duì)照組比較，模型組大鼠動(dòng)脈造影血流緩慢，有少量側(cè)支循環(huán)形成，并相互連接成毛細(xì)血管網(wǎng)，但末端小動(dòng)脈顯影減弱。與模型組

4、比較，各用藥組大鼠動(dòng)脈造影顯示血流及末端小動(dòng)脈顯影均有不同程度改善，有側(cè)支循環(huán)形成及毛細(xì)血管網(wǎng)形成，其中T-MSCs造影血流通暢，末端小動(dòng)脈顯影最清晰。
　　2.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)糖尿病足大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和晚期糖基化終末產(chǎn)物的影響
　　2.1.HE染色普通光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠缺血下肢肌組織病理變化
　　對(duì)照組肌纖維排列稍有紊亂，偶可見(jiàn)肌間質(zhì)纖維化，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肌纖維排列紊亂明顯，肌

5、間質(zhì)部分纖維化，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。各用藥組肌纖維排列、肌間質(zhì)纖維化及炎細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減輕，其中TXL和T-MSCs減輕較明顯。
　　2.2.透射電鏡觀察各組大鼠缺血下肢肌組織超微結(jié)構(gòu)
　　對(duì)照組:肌節(jié)、肌絲排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，少部分線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)模糊不清，肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張，肌膜完整。模型組:部分肌絲融合、模糊、增寬，肌原纖維稀疏、間隙增寬、有斷裂，部分線粒體水腫，嵴結(jié)構(gòu)斷裂、溶解，空泡變性，可見(jiàn)髓體樣化改變，外膜局部溶解、消

6、失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有擴(kuò)張，肌細(xì)胞核間隙增寬。各用藥組:上述肌組織超微結(jié)構(gòu)均不同程度減輕，以TXL和T-MSCs結(jié)構(gòu)病變減輕較為明顯。
　　2.3.各組大鼠血清IL-1、IL-6及TNF-α水平比較
　　與對(duì)照組比較，模型組血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，PB-MSCs血清IL-1、IL-6和TNF-α水平有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;余用藥組血清IL-1、IL-6和TN

7、F-α水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2.4.各組大鼠血清SOD和MDA水平比較
　　與對(duì)照組比較，模型組血清SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組血清SOD水平均明顯升高、MDA水平均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.5.各組大鼠血清AGEs水平比較
　　與對(duì)照組比較，模型組血清AGEs水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，PB-

8、MSCs血清AGEs水平有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，余用藥組血清AGEs水平均明顯降低(P＜0.05)。
　　2.6.各組大鼠缺血下肢肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)比較
　　與對(duì)照組比較，模型組肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，PB-MSCs肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，余用藥組肌組織中IC

9、AM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中T-MSCs肌組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平最低。
　　3.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足大鼠促血管新生的機(jī)制研究
　　3.1.透射電鏡觀察糖尿病足大鼠缺血下肢肌肉微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
　　對(duì)照組:內(nèi)皮細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)清晰，少部分細(xì)胞外基質(zhì)膜模糊。模型組:內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞內(nèi)線粒體少部分膜模糊不清，細(xì)胞間隙稍擴(kuò)張，細(xì)胞

10、外基質(zhì)松散、不連續(xù)，部分區(qū)域溶解。各用藥組:與模型組比較，TXL和Cilostazol內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)不同程度減輕;PB-MSCs內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，大部分細(xì)胞外基質(zhì)縮窄、閉合、溶解、消失，管腔極度狹窄;T-MSCs和C-MSCs可見(jiàn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3.2.各組大鼠缺血下肢肌組織CD34和CD105蛋白表達(dá)比較
　　與對(duì)照組比較，模型組肌組織中CD34和CD105蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥

11、組肌組織中CD34和CD105蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)。其中T-MSCs肌組織中CD34和CD105蛋白表達(dá)最高。
　　3.3.各組大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平比較
　　與對(duì)照組比較，模型組血清VEGF-A和HIF-1α水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組血清VEGF-A水平均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，T-MSCs和C-MSCs血清中HIF-1α水平顯著升高(P＜0.01)。

12、與PB-MSCs比較，T-MSCs和C-MSCs血清中HIF-1α水平明顯升高(P＜0.05)。
　　3.4.各組大鼠缺血下肢肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達(dá)比較
　　與對(duì)照組比較，模型組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中VEGF-A和VEGF-

13、R2蛋白表達(dá)均高于Cilostazol(P＜0.05); T-MSCs和C-MSCs肌組織中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表達(dá)均高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P＜0.01)。
　　3.5.各組大鼠缺血下肢肌組織中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表達(dá)比較
　　與對(duì)照組比較，模型組肌組織中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組肌組織中VEGF-A

14、和cyclinD1mRNA表達(dá)均明顯升高(P＜0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中VEGF-A和cyclinD1mRNA表達(dá)高于TXL和Cilostazol(P＜0.05);T-MSCs和C-MSCs肌組織中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表達(dá)高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P＜0.01)。
　　3.6.各組大鼠缺血下肢肌組織中cyclinD1、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達(dá)比較

15、r>　　與對(duì)照組比較，模型組肌組織中cyclinD1和p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低，p-GSK-3β蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，各用藥組cyclinD1和p-Akt蛋白表達(dá)均顯著升高，p-GSK-3β蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。各用藥組組間比較，PB-MSCs肌組織中cyclinD1和p-Akt蛋白表達(dá)高于TXL和Cilostazol(P＜0.01，P＜0.05);T-MSCs和C-MSCs肌組織中cyclin

16、D1和p-Akt蛋白表達(dá)高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs，p-GSK-3β蛋白表達(dá)低于TXL、Cilostazol及PB-MSCs(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)，從“脈絡(luò)-血管”保護(hù)切入，提出通絡(luò)干預(yù)防治糖尿病足作用可通過(guò)改善干細(xì)胞移植的缺血區(qū)局部微環(huán)境、促進(jìn)治療性血管新生及側(cè)支循環(huán)建立，有效治療糖尿病足。
　　2.在增加糖尿病足大鼠缺血下肢血流灌注量、側(cè)支

17、循環(huán)建立方面，通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療優(yōu)于單純干細(xì)胞組，同時(shí)可以改善糖尿病足大鼠體重，降低HOMA-IR、增高Ln(ISI)，降低脂質(zhì)代謝紊亂。
　　3.通心絡(luò)聯(lián)合外周血間充質(zhì)干細(xì)胞可減輕炎癥水平，提高抗氧化能力，減少晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積，減輕肌組織損傷病理及超微結(jié)構(gòu)變化，其抗炎能力優(yōu)于單純干細(xì)胞組，提示通心絡(luò)可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)和氧化損傷，進(jìn)而改善干細(xì)胞移植后的微環(huán)境，提高外周血間充質(zhì)干細(xì)胞局部肌肉移植后血管新生。