β-巰基乙醇在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化和H2O2誘導(dǎo)的凋亡中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:脊髓損傷多由于物理創(chuàng)傷引起，是一種會(huì)導(dǎo)致脊髓損傷支配平面以下的肢體功能喪失的一種的損傷。脊髓損傷可能發(fā)生于脊髓的各個(gè)節(jié)段，可分為完全損傷和不完全損傷，表現(xiàn)為不同程度的感覺(jué)功能、運(yùn)動(dòng)功能以及各種生理反射的異常或者喪失。干細(xì)胞的移植，能夠在一定程度地改善損傷脊髓的功能，但是受限于被移植細(xì)胞的分化率，治療效果并不理想，更達(dá)不到臨床應(yīng)用的水準(zhǔn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離獲得、增殖迅速、免疫原性低并具有跨胚層分化的潛能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一種是

2、多能干細(xì)胞，具有體外增值能力，還有分化為骨、肌肉、神經(jīng)等多種胚層來(lái)源細(xì)胞的潛在能力。某些抗氧化劑能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化。正常產(chǎn)生的活性氧會(huì)在自由基清除酶和抗氧化劑的參與下被清除。在很多條件下，活性氧還參與了調(diào)節(jié)多種諸如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等細(xì)胞的生理過(guò)程。大量的活性氧不能被體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)和細(xì)胞內(nèi)的小分子抗氧化劑及時(shí)清除，就會(huì)造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡、壞死。有效地控制活性氧水平能夠抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)干細(xì)

3、胞分化，繼而提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的療效。
　　研究方法:本研究中我們將實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分中，在體外培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用β-巰基乙醇誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，采用鏡下觀察以及神經(jīng)元特異性標(biāo)記物檢測(cè)來(lái)確定細(xì)胞的分化。以空白對(duì)照組和H2O2處理組與β-巰基乙醇誘導(dǎo)組進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測(cè)定，以及相關(guān)通路的表達(dá)測(cè)定，尋找Notch1信號(hào)通路與活性氧濃度之間的關(guān)系。在第二部的實(shí)驗(yàn)中，們用H2O2

4、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生凋亡，并用H2O2/β-巰基乙醇共同處理細(xì)胞，來(lái)發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇對(duì)凋亡的抑制作用。通過(guò)光鏡，熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法，對(duì)比各組之間凋亡的差異。對(duì)比各組之間的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，以及凋亡相關(guān)通路，來(lái)探究β-巰基乙醇抗凋亡的機(jī)制。
　　結(jié)果:β-巰基乙醇誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，倒置相差鏡下觀察，BMSCs的細(xì)胞質(zhì)逐漸向細(xì)胞核收縮，細(xì)胞體逐漸向多極形狀變化，并軸向向遠(yuǎn)端延伸。倒置熒光顯微鏡下

5、，誘導(dǎo)5小時(shí)后的BMSCs細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出NSE的高表達(dá)。Western blot分析:NSE的表達(dá)隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)升高。Nestin的表達(dá)隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)升高。Notch1的表達(dá)隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)降低。檢測(cè)β-巰基乙醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的作用，DCFH-DA測(cè)定:β-巰基乙醇能夠降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，H2O2能夠提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。Western blot分析:Notch1和Hes1的表達(dá)與ROS的水平正相關(guān)。H2O2誘導(dǎo)BM

6、SCs凋亡，β-巰基乙醇抑制凋亡。倒置相差顯微鏡下觀察:H2O2處理組中的細(xì)胞視野當(dāng)中可見(jiàn)大量體積縮小、亮度增加的凋亡細(xì)胞。 H2O2/β-巰基乙醇共同處理的體積縮小、亮度增加的凋亡細(xì)胞數(shù)量較H2O2處理組明顯下降。Hoechst33258染色:H2O2處理組中的細(xì)胞視野當(dāng)中可見(jiàn)大量細(xì)胞核致密濃染或呈碎塊濃染的凋亡狀態(tài)。而H2O2/β-巰基乙醇共同處理的凋亡細(xì)胞數(shù)量較H2O2處理組明顯下降了。流式雙染細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:H2O2處理

7、組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率明顯上升了。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組與H2O2處理組相比，細(xì)胞凋亡率明顯下降了。DCFH-DA測(cè)定:H2O2能夠提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組ROS比H2O2處理組降低了。Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組相比，H2O2處理組的Bax和caspase3的表達(dá)上升了，而抑制凋亡的Bcl-2的表達(dá)下降了。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組與H2O2處理組相比

8、，Bax和caspase3的表達(dá)下降了，而抑制凋亡的Bcl-2的表達(dá)上升了。Akt表達(dá)沒(méi)有明顯差異。與空白對(duì)照組相比，H2O2處理組的p-Akt的表達(dá)下降了。H2O2/β-巰基乙醇共同處理組與H2O2處理組相比p-Akt的表達(dá)上升了。
　　結(jié)論:β-巰基乙醇作為一種抗氧化劑，在適當(dāng)?shù)臐舛认履軌蛟隗w外促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，這一過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)活性氧的下降，Notch1信號(hào)通路抑制，Hes1基因表達(dá)下降有關(guān)。β-巰基乙醇能