荔枝果肉不同酚類成分群體外抑制肝細胞脂肪變性的活性差異及其機制研究.pdf

1、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是亞熱帶地區(qū)的主要特色水果，其果肉營養(yǎng)豐富，我國傳統(tǒng)中醫(yī)認為荔枝具有健脾、益肝和美容之功效?，F(xiàn)代研究表明荔枝果肉富含酚類物質，具有顯著的抗氧化活性，且對高脂負荷小鼠脂質代謝紊亂具有明顯的改善作用，但實驗采用的都是含有多種酚類物質的混合提取物，其有效的酚類成分尚不明確。為此，本研究將荔枝果肉多酚提取物分離成不同的酚類成分群，比較不同酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量、單體酚組成及抗氧

2、化活性差異;通過體外肝細胞脂肪變性模型，比較荔枝果肉不同酚類成分群對肝細胞脂質聚集的抑制作用差異，在此基礎上，明確荔枝果肉改善肝細胞脂肪變性的最主要酚類物質;結合real time RT-PCR和western blot等分析技術，進一步探討荔枝果肉主要酚類物質改善肝細胞脂肪變性的分子機制及主要信號通路。主要研究結果如下:
　　1.荔枝果肉不同酚類成分群的分離鑒定及抗氧化活性比較
　　采用C18硅膠層析柱將荔枝果肉多酚提取物

3、可分為F1、F2、F3和F4共4個酚類成分群，其中F2的得率高達36％，其他成分群得率分別為18.71％、16.79％、21.12％;各酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量分別介于218.86-499.78 mg GAE/gDW、414.94-1285.45 mg RE/g DW、83.35-483.43 mg CE/g DW。4個成分群中F2的總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，對荔枝果肉多酚提取物相應的總量貢獻率最大，分別達50.3％

4、、54.2％、72.1％，均高于其余3個成分群的貢獻率;其次是F3和F4; F1的最低。經HPLC-DAD和LC-ESI-MS分析和鑒定發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2成分群主要為原花青素B2、表兒茶素、A-型原花青素三聚體、B-型原花青素三聚體、B-型原花青素二聚體等單體酚，F(xiàn)3僅含槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷一種單體酚，F(xiàn)4中含有蘆丁、山奈酚-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷和異鼠李素-蕓香糖苷等。4個酚類成分群的FRAP

5、抗氧化能力大小順序為F2＞F3＞F4＞F1(p＜0.05);DPPH消除能力的IC50值分別為27.00、9.76、19.41、16.25μg·mL-1，其中F2的IC50值最小，即DPPH消除能力最強，其次是F4、F3，F(xiàn)1最弱;ORAC抗氧化能力順序為F2＞F3＞F4＞F1(p＜0.05)，CAA抗氧化能力順序為F2＞F3＞F4≈F1(p＜0.05)，其中F2的ORAC和CAA抗氧化能力分別為8.36 mmol TE/g DW和19

6、0.71μmol QE/gDW，對荔枝果肉多酚提取物ORAC和CAA值的貢獻率分別高達50.4％和84.9％。由此可見，荔枝果肉4個酚類成分群間的總酚、總黃酮和縮合單寧含量及抗氧化活性均存在顯著差異，各成分群的單體酚組成亦各有特點，其中F2成分群的得率及總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，抗氧化活性最好，是荔枝果肉抗氧化作用的最主要酚類物質。
　　2.荔枝果肉不同酚類成分群體外抑制肝細胞脂肪變性的活性差異研究
　　以油酸誘導人肝

7、癌HepG2細胞發(fā)生脂肪沉積，建立體外肝細胞脂肪變性模型。比較不同濃度油酸(OA)誘導下HepG2細胞甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量，谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)水平以及丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果表明，油酸濃度不高于0.4 mmol/L時，細胞內TG和TC含量顯著升高，呈現(xiàn)劑量依賴性，且ALT、AST水平以及MDA含量和SOD活性無明顯變化，未引起細胞損傷。因此，以0.4 mmol/L

8、油酸為誘導劑，建立單純性肝細胞脂肪變性模型。探討4個酚類成分群對油酸誘導HepG2細胞內脂質聚集的抑制作用，結果表明，5-40μg/mL濃度范圍內，F(xiàn)1、F2、F3和F44個酚類成分群中F2成分群抑制細胞內TG沉積的效果最好，5μg/mL時對細胞內TG的抑制率高達26.9％。F3的抑制作用僅次于F2的，10μg/mL時細胞內TG含量下降了26.2％。F4的抑制效果相對較弱，20μg/mL時才達到最大抑制率為19.3％。而F1的抑制效果最

9、差，濃度達到40μg/mL時才具有一定抑制作用，抑制率僅為11％。各酚類成分群對細胞內TC含量的抑制作用大小與TG的結果一致，亦為F2＞F3＞F4＞F1(p＜0.05)。此外，研究各成分群的復配作用，結果表明F2和F3顯示出協(xié)同抑制肝細胞內脂質聚集的作用，而F4未顯示出對F2和F3的協(xié)同作用。由此提示F2和F3成分群是荔枝果肉改善肝細胞脂肪變性的主要酚類物質。
　　3.荔枝果肉主要酚類物質體外抑制肝細胞脂肪變性的作用機制研究

10、>　　荔枝果肉酚類成分群F3僅含槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷(QRR)一種單體酚，是荔枝果肉改善肝細胞脂肪變性的最主要酚類物質之一，則以QRR為研究對象，采用體外HepG2細胞脂肪變性模型，實驗分為對照組、油酸模型組以及不同濃度QRR組。用real time RT-PCR和western blot檢測各組細胞內肝臟脂質代謝相關基因和蛋白的表達情況。結果表明，QRR能顯著降低肝臟清道夫受體CD36、脂肪酸轉運蛋白2（FATP-

11、2）的mRNA水平和FATP-2的蛋白表達(p＜0.05)，減少肝細胞對外源性脂肪酸的吸收，并呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢;各劑量組均能降低甘油三酯合成的關鍵酶二酯酰甘油?；D移酶（DGAT1和DGAT2）基因的mRNA水平以及DGAT1的蛋白表達水平(p＜0.05)，但對DGAT2的蛋白表達影響不顯著;QRR還可促使腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化，活化過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα），上調脂肪酸氧化的相關基因如肉毒堿棕櫚酰轉移酶-

12、1α(CPT-1α)的表達，但對固醇調節(jié)元件結合蛋白1-c(SREBP1-c)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)等脂肪酸合成相關基因的表達無明顯影響。此外，采用CompoundC抑制AMPK的激活，QRR抑制HepG2細胞內脂質聚集的作用仍然存在，表明QRR改善肝細胞脂肪變性的作用途徑不是完全依賴于AMPK信號通路。綜述所述，QRR改善肝細胞脂肪變性的作用機制主要是調節(jié)脂肪酸吸收、氧化以及甘油三酯合成的相關基因和蛋白表