金屬輔基對(duì)神經(jīng)紅蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響.pdf

1、神經(jīng)紅蛋白(Neuroglobin,NGB)是2000年由德國(guó)科學(xué)家Burmester,T等在人和鼠腦中發(fā)現(xiàn)的一種新穎的珠蛋白。相對(duì)于血紅蛋白和肌紅蛋白中血紅素Fe的五配位形式,神經(jīng)紅蛋白中的血紅素Fe是六配位形式。這種結(jié)構(gòu)的蛋白在脊椎動(dòng)物中還屬于首例,新的結(jié)構(gòu)必然會(huì)賦予該蛋白新的性質(zhì)與功能。為研究NGB的基本化學(xué)生物學(xué)性質(zhì)及金屬輔基與蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)之間的關(guān)系,我們研究了脫輔基神經(jīng)紅蛋白(apoNGB)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),并研究了錳、鈷卟啉重

2、組神經(jīng)紅蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),進(jìn)一步研究了酯化血紅素重組神經(jīng)紅蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。
　　1.分別用丁酮萃取法和酸丙酮法制備了apoNGB。用丁酮萃取法制備的apoNGB產(chǎn)率高(90％以上),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,但還含有一定的全蛋白;而用酸丙酮法制備的apoNGB較純,但產(chǎn)率相對(duì)較低(70%左右),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性低。和NGB相比,apoNGB的色氨酸進(jìn)一步暴露于極性溶劑中,α-螺旋的含量降低。
　　2. apoNGB的去折疊研究。apoNGB在酸

3、中去折疊過(guò)程為:天然態(tài)(N)?部分去折疊態(tài)(UA)?熔球態(tài)(MG)。apoNGB的熱變性研究表明,apoNGB和NGB的熱變性中點(diǎn)為66.0℃和90.8℃,說(shuō)明血紅素輔基對(duì)蛋白的肽鏈具有穩(wěn)定作用。尿素濃度達(dá)到9 mol·L-1時(shí),apoNGB的肽鏈并沒(méi)有完全伸展,主要是色氨酸逐漸暴露于極性環(huán)境中。在9 mol·L-1尿素下,熒光探針ANS結(jié)合在肽鏈上的疏水區(qū)域并沒(méi)有完全暴露于極性溶劑中;而在4 mol·L-1鹽酸胍下,此疏水區(qū)域則完全暴

4、露于極性溶劑中。apoNGB在鹽酸胍中變性完全,鹽酸胍的變性能力明顯高于尿素。熒光相圖表明,apoNGB在鹽酸胍和尿素中的去折疊過(guò)程不同。由ANS和脫輔基神經(jīng)紅蛋白結(jié)合的熒光光譜得到其解離常數(shù)KD=14μmol·L-1,結(jié)合部位數(shù)n為1.2。ANS-apoNGB的熒光可被1.2倍的血紅素所猝滅,說(shuō)明ANS結(jié)合在apoNGB的血紅素區(qū)域。
　　3.利用UV-Vis光譜和熒光光譜研究了apoNGB與錳卟啉的結(jié)合過(guò)程。結(jié)果表明,當(dāng)兩者濃

5、度相等時(shí),反應(yīng)基本到達(dá)平衡,說(shuō)明apoNGB與錳卟啉以1:1的摩爾比結(jié)合。用UV-Vis光譜、熒光光譜、CD光譜、電噴霧質(zhì)譜對(duì)錳卟啉重組蛋白(Mn-NGB)進(jìn)行了表征。小分子配體SCN-、N3-、CN-與Mn-NGB不反應(yīng),說(shuō)明Mn-NGB表現(xiàn)為反應(yīng)較惰性。Mn-NGB的鹽酸胍變性研究表明,隨著蛋白肽鏈的去折疊,錳卟啉從肽鏈上脫離下來(lái)。Mn-NGB穩(wěn)定性小于NGB。熒光相圖表明,Mn-NGB在鹽酸胍中的去折疊存在三種狀態(tài)。Mn-NGB的

6、熱變性中點(diǎn)為74.7℃,說(shuō)明Mn-NGB的熱穩(wěn)定性降低。因此,卟啉中錳金屬的替換影響了輔基的配位環(huán)境,對(duì)蛋白質(zhì)中的空間構(gòu)象產(chǎn)生了微擾,從而導(dǎo)致蛋白肽鏈的穩(wěn)定性有所下降。
　　4.利用UV-Vis光譜和熒光光譜研究了apoNGB與鈷卟啉的結(jié)合過(guò)程。結(jié)果表明,當(dāng)兩者濃度相等時(shí),反應(yīng)基本到達(dá)平衡,說(shuō)明apoNGB與鈷卟啉以1:1的摩爾比結(jié)合。用UV-Vis光譜、熒光光譜、CD光譜對(duì)鈷卟啉重組蛋白(Co-NGB)進(jìn)行了表征。小分子配體SC

7、N-、N3-與Co-NGB不反應(yīng),但CN-可反應(yīng),說(shuō)明Co-NGB較Mn-NGB反應(yīng)性高些。Co-NGB的鹽酸胍變性研究表明,鈷卟啉并沒(méi)有從肽鏈上脫離下來(lái)。Co-NGB在鹽酸胍中的去折疊符合―兩態(tài)模型‖。Co-NGB鹽酸胍CD變性曲線不同于NGB,說(shuō)明鈷金屬影響了蛋白和變性劑的相互作用。Co-NGB的熱變性中點(diǎn)為82.7℃,說(shuō)明Co-NGB的熱穩(wěn)定性下降。Co-NGB在不同pH下的去折疊研究表明:Co-NGB在堿性條件下比較穩(wěn)定;而在酸

8、性條件下則先形成部分去折疊態(tài),然后再形成熔球態(tài)。ANS熒光光譜表明, ANS不能和Co-NGB結(jié)合。
　　5.合成了氯化血紅素的衍生物對(duì)甲基苯酚雙酯氯化血紅素和苯酚雙酯氯化血紅素,采用電噴霧質(zhì)譜,紫外-可見(jiàn)吸收光譜等進(jìn)行了表征。將人工合成的氯化血紅素的雙酯衍生物與apoNGB重組,制備得到了酯化血紅素重組NGB。重組NGB的光譜表明,重組NGB的ASoret/A280值都小于NGB(3.0),重組NGB的色氨酸進(jìn)一步暴露于極性環(huán)境