全反式維甲酸和TGF-β1協(xié)同調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)及促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化是血管重塑性疾病，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的重要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。Krüppel樣因子4(krüppel-like factor4，GKLF/KLF4)是KLF家族中與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞重編程和癌癥發(fā)生密切相關(guān)的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。在VSMC中，KLF4具有抗增殖和促分化的作用。維生素A衍生物全反式維甲酸(al

2、l-trans retinoic acid，ATRA)通過與受體RAR(retinoic acid receptor)和 RXR(retinoid X receptor)相互作用，對(duì)多種細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通過與細(xì)胞膜受體TβR-Ⅰ(TGF-β typeⅠ receptor)或TBR-Ⅱ(TGF-β typeⅡ receptor)

3、結(jié)合觸發(fā)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡的信號(hào)途徑。在VSMC中，ATRA和TGF-β1均可誘導(dǎo)KLF4基因的表達(dá)及促進(jìn)VSMC分化，但ATRA和TGF-β1對(duì)KLF4基因表達(dá)和VSMC分化是否具有協(xié)同效應(yīng)目前尚不清楚。本研究觀察ATRA和TGF-β1對(duì)VSMC中KLF4表達(dá)的影響，探討ATRA和TGF-β1協(xié)同調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)及VSMC分化的分子機(jī)制。
　　方法：用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC；Western blot分析檢測(cè)KL

4、F4、SM22α、PCNA、cyclin D1和p21的表達(dá)；細(xì)胞計(jì)數(shù)法和BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；HE染色和鬼比環(huán)肽染色觀察細(xì)胞形態(tài)和應(yīng)力纖維的變化；傷口愈合實(shí)驗(yàn)和VSMC跨膜遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的平面遷移和跨膜遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1 ATRA和TGF-β1協(xié)同調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)
　　以10μmol/L ATRA或1μmol/L9cRA刺激VSMC2 h后，加入2 ng/mLTGF-μ1孵育24 h，收集

5、細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，單獨(dú)給予ATRA或TGF-β1刺激后，KLF4表達(dá)水平均比對(duì)照組顯著升高，聯(lián)合應(yīng)用ATRA和TGF-β1刺激VSMC，可進(jìn)一步上調(diào)KLF4表達(dá)水平，二者具有協(xié)同效應(yīng)。單獨(dú)給予9cRA或9cRA與TGF-β1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)KLF4表達(dá)無明顯影響。以上結(jié)果表明，ATRA和TGF-β1協(xié)同激活KLF4基因表達(dá)。
　　2抑制維甲酸受體RARα激活可阻斷TGF-β1對(duì)KLF4表達(dá)的

6、誘導(dǎo)作用
　　維甲酸受體RAR有三種亞型，即：RARα、RARβ和RARγ，其中，RARα在VSMC分化過程中發(fā)揮重要作用。以上研究證實(shí)，ATRA和TGF-β1協(xié)同激活KLF4基因表達(dá)。為了檢查ATRA和TGF-β信號(hào)之間是否存在聯(lián)系，我們用RARα特異性抑制劑Ro41-5253(20μmol/L)抑制RARα活性后，再用TGF-β1(2 ng/mL)刺激VSMC24 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析。

7、結(jié)果表明，在Ro41-5253預(yù)處理的細(xì)胞中，TGF-β1上調(diào)KLF4表達(dá)的作用被阻斷，提示TGF-β1上調(diào)KLF4表達(dá)有賴于維甲酸信號(hào)的活化。
　　3 ATRA和TGF-β1協(xié)同抑制VSMC增殖
　　為了進(jìn)一步確定ATRA和TGF-β1協(xié)同激活KLF4表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)，我們觀察ATRA和TGF-β1對(duì)VSMC增殖相關(guān)基因PCNA及細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1和負(fù)調(diào)節(jié)蛋白p21表達(dá)的影響。結(jié)果表明，ATRA和TGF-

8、β1協(xié)同抑制PCNA和cyclin D1表達(dá)，促進(jìn)p21表達(dá)。用RARα特異性抑制劑Ro41-5253抑制RARα活性后，在一定程度上阻斷TTGF-β1對(duì)PCNA表達(dá)的下調(diào)作用。細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU摻入結(jié)果顯示，用ATRA和TGF-β1處理細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)及BrdU摻入率均較對(duì)照組明顯減少，表明二者協(xié)同抑制VSMC增殖。
　　4 ATRA和TGF-β1協(xié)同誘導(dǎo)VSMC分化
　　為了探討ATRA和TGF-β1對(duì)VSMC分化和細(xì)胞

9、生物學(xué)行為的影響，我們用ATRA和TGF-β1單獨(dú)或聯(lián)合刺激VSMC后，分別檢查VSMC分化標(biāo)志基因SM22α表達(dá)、細(xì)胞骨架形態(tài)變化和細(xì)胞遷移活性。結(jié)果表明，單獨(dú)給予ATRA或TGF-β1刺激均能上調(diào)SM22α表達(dá)，二者聯(lián)合刺激VSMC后，SM22α的表達(dá)比單一因素刺激進(jìn)一步增加。用RARα特異性抑制劑Ro41-5253抑制RARα活性后，TGF-β1對(duì)SM22α表達(dá)的上調(diào)作用受到抑制。HE染色和鬼筆環(huán)肽染色均顯示，聯(lián)合應(yīng)用ATRA和T

10、GF-β1刺激VSMC后，細(xì)胞形態(tài)由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞骨架規(guī)則，肌絲粗大；細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Boyden小室跨膜遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATRA和TGF-β1聯(lián)合刺激可顯著抑制VSMC遷移。以上結(jié)果表明，ATRA和TGF-β1通過協(xié)同誘導(dǎo)VSMC分化而抑制VSMC遷移。
　　結(jié)論：
　　1 ATRA和TGF-β1協(xié)同調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)。
　　2抑制維甲酸受體RARα激活可阻斷TGF-β1對(duì)KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。