TGF-β1HEPPARα激動(dòng)劑協(xié)同抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)表型具有可塑性，在細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)刺激下，其表型和增殖、遷移、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為可以發(fā)生改變。VSMC表型轉(zhuǎn)化是動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增殖性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。Krüppel樣因子4(krüppel-likefactor，KLF4)是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其羧基端存在3個(gè)連續(xù)的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。KLF4通過直接與DNA結(jié)合來調(diào)節(jié)與

2、細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activatedreceptors，PPARs)作為核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)與細(xì)胞分化、發(fā)育、代謝及腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)。PPARs有三種類型，即α、β/δ、γ，其中PPARα在血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)和VSMC中廣泛表達(dá)，具有抗炎及抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。Fen

3、ofibrate作為PPARα的激動(dòng)劑，已經(jīng)作為臨床藥物在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病中廣泛應(yīng)用。
　　TGF-β家族成員是多功能細(xì)胞因子，與靶細(xì)胞膜上的Ⅰ型或Ⅱ型絲-蘇氨酸激酶受體結(jié)合后，通過激活多種信號通路調(diào)控VSMC增殖、分化、凋亡等過程。雖然TGF-β1、PPARα和KLF4均參與細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，但三者在調(diào)節(jié)VSMC增殖和分化方面的內(nèi)在聯(lián)系和相互之間的關(guān)系尚不清楚。
　　本研究觀察TGF-β1和PPARα

4、激動(dòng)劑Fenofibrate對VSMC增殖的影響，探討二者協(xié)同抑制VSMC增殖的分子機(jī)制，以期為動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為心血管疾病的防治提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　方法：Western blot分析檢測KLF4、SM22α和cyclin E等基因的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況；細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)；傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Boyden小室觀察細(xì)胞的遷移

5、活性。
　　結(jié)果：
　　1 TGF-β1和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate協(xié)同促進(jìn)KLF4基因表達(dá)
　　Western blot分析結(jié)果顯示，分別給予TGF-β1(2 ng/mL)和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate(F6020，50μM)后，KLF4表達(dá)水平明顯增加；同時(shí)給予二者后，KLF4表達(dá)水平比單一因素刺激進(jìn)一步增加。用PPARα抑制劑GW6471(10μM)處理細(xì)胞后，KLF4的基礎(chǔ)表達(dá)及TGF-β

6、1誘導(dǎo)的KLF4表達(dá)均被抑制。這些結(jié)果表明，TGF-β1與PPARα信號協(xié)同促進(jìn)KLF4基因的表達(dá)。
　　2 TGF-β1和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate協(xié)同誘導(dǎo)VSMC分化
　　單獨(dú)用TGF-β1或PPARα激動(dòng)劑F6020處理VSMC后，SM22α和SM-α-actin的表達(dá)均明顯升高；同時(shí)給予F6020和TGF-β1后，SM22α和SM-α-actin的表達(dá)比單一因素刺激進(jìn)一步升高。PPARα抑制劑GW6471

7、能在一定程度上抑制TGF-β1對SM22α和SM-α-actin表達(dá)的誘導(dǎo)作用，這些結(jié)果表明，TGF-β1與Fenofibrate協(xié)同誘導(dǎo)VSMC的分化。
　　3 TGF-β1和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate協(xié)同抑制VSMC增殖
　　上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β1和F6020協(xié)同誘導(dǎo)VSMC分化，為了觀察TGF-β1和Fenofibrate對VSMC增殖的影響，單獨(dú)用TGF-β1或F6020處理VSMC或同時(shí)用二者聯(lián)合刺激

8、VSMC后，用Western blot分析檢查PCNA表達(dá)，細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢查VSMC增殖活性。結(jié)果顯示，TGF-β1和F6020均抑制PCNA表達(dá)，而且二者聯(lián)合能增強(qiáng)對PCNA表達(dá)的抑制作用。細(xì)胞計(jì)數(shù)和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，TGF-β1和F6020聯(lián)合作用可增強(qiáng)對VSMC增殖的抑制作用。這些結(jié)果表明，TGF-β1與F6020協(xié)同抑制VSMC增殖。
　　4 TGF-β1和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate抑制

9、VSMC增殖與阻抑cyclin E表達(dá)和細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)
　　為了進(jìn)一步探討TGF-β1和Fenofibrate抑制VSMC增殖的分子機(jī)制，我們檢測二者對細(xì)胞周期蛋白cyclin E表達(dá)的影響。Western blot分析結(jié)果顯示，TGF-β1和F6020均能抑制cyclin E表達(dá)，且二者對cyclin E表達(dá)具有協(xié)同抑制作用。
　　流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析結(jié)果顯示，與對照組相比，用TGF-β1或F6020處理VSMC24

10、 h后，G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少，表明TGF-β1或F6020作用于VSMC后，細(xì)胞的增殖活性降低；當(dāng)二者聯(lián)合作用于VSMC時(shí)，細(xì)胞增殖活性的降低更為顯著。
　　5 TGF-β1和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate協(xié)同抑制VSMC遷移
　　用傷口愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞跨膜遷移實(shí)驗(yàn)分析TGF-β1和Fenofibrate對VSMC遷移的影響，結(jié)果顯示，給予TGF-β1、F6020、及TGF-β

11、1和F6020聯(lián)合刺激后，對VSMC平面和跨膜遷移活性的抑制程度依次升高，TGF-β1和F6020聯(lián)合作用對VSMC遷移的抑制作用最強(qiáng)，說明二者協(xié)同抑制VSMC遷移。
　　結(jié)論：
　　1 TGF-β1和PPARα激動(dòng)劑Fenofibrate通過促進(jìn)VSMC標(biāo)志基因SM22α和SM-α-actin表達(dá)協(xié)同誘導(dǎo)VSMC分化。
　　2 TGF-β1和Fenofibrate通過抑制cyclin E表達(dá)及細(xì)胞周期進(jìn)程，協(xié)同抑制V