脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及其構(gòu)建物新型低溫保存方法研究.pdf

1、低溫保存對(duì)于細(xì)胞、組織、器官甚至新近出現(xiàn)的生物復(fù)合物的長(zhǎng)期儲(chǔ)存是一種有效的不可或缺的方法，被廣泛應(yīng)用到干細(xì)胞治療、生物組織工程、再生醫(yī)學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。低溫的深度保存(-196℃)主要包括慢速降溫的兩步法保存和快速的玻璃化保存。慢速降溫的兩步法保存是目前應(yīng)用最廣的方法，但仍然存在著一定的缺陷，尤其是在干細(xì)胞及生物材料的保存中。在慢速降溫的兩步法保存過程中，細(xì)胞或生物材料內(nèi)會(huì)產(chǎn)生冰晶，這將造成細(xì)胞和生物材料的機(jī)械性損傷，而且在慢速降溫過程

2、中還存在著溶質(zhì)損傷。同時(shí)，干細(xì)胞的慢速保存可能會(huì)影響干細(xì)胞功能等。玻璃化低溫保存可以避免在冷凍降溫時(shí)冰晶的形成，但是傳統(tǒng)的玻璃化保存應(yīng)用到了高濃度的低溫保護(hù)劑，這會(huì)造成細(xì)胞的毒性損傷。因此，探索低濃度低溫保護(hù)劑下的玻璃化低溫保存方法是非常必要的。低濃度玻璃化保存方法面臨最大的挑戰(zhàn)是復(fù)溫過程中再結(jié)晶的發(fā)生，所以，了解再結(jié)晶發(fā)生的原因以及影響因素是非常重要的。
　　本文首先利用低溫顯微鏡檢測(cè)了懸浮和貼壁兩種狀態(tài)下的細(xì)胞在不同降溫速率下

3、和不同溶液中的胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成概率以及冷凍復(fù)溫后細(xì)胞的活性。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著降溫速率的增加，胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成概率有所增加。同時(shí)，在有1M DMSO存在的條件下，胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成會(huì)比在PBS中有所延遲。雖然在1M DMSO溶液中，胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成概率比在PBS溶液中高些，但是復(fù)溫后的存活率也高，這可能是因?yàn)楸纬芍皇羌?xì)胞損傷的一種因素，在低溫保存中，低溫保護(hù)劑可以保護(hù)細(xì)胞，比如穩(wěn)定細(xì)胞膜等。相對(duì)于懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞在同樣

4、的降/復(fù)溫過程中，其胞內(nèi)冰形成概率會(huì)高很多，但是復(fù)溫后的細(xì)胞活性卻比懸浮細(xì)胞要高，這是因?yàn)榧?xì)胞間的間隙連接可以避免細(xì)胞在冷凍過程中過度脫水，同時(shí)在低溫環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞等。
　　已有研究表明納米顆粒在溶液冷凍時(shí)可以促進(jìn)其冰晶形成等，而Fe3O4納米顆粒已經(jīng)被應(yīng)用到組織冷凍的復(fù)溫過程中，但是它對(duì)凍存溶液的影響研究的還不多，因此我們利用低溫顯微鏡觀察不同濃度的Fe3O4納米顆粒對(duì)溶液冰晶形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中添加Fe3O4納米顆粒

5、后，冰晶成核的溫度點(diǎn)會(huì)提高10℃左右，同時(shí)冰晶生長(zhǎng)的速率也會(huì)增加。這是因?yàn)樵谶@個(gè)冷凍過程中，納米顆?？梢员豢醋魇潜纬傻某珊藙亩龠M(jìn)冰晶成核及生長(zhǎng)。
　　在以往的低濃度低溫保護(hù)劑的玻璃化低溫保存研究中，人們常常用海藻酸鹽凝膠來抑制復(fù)溫過程中反玻璃化的發(fā)生，但是對(duì)于海藻酸鹽水凝膠的低溫顯微鏡的研究還比較少。我們利用低溫顯微鏡來研究一定厚度(200μm)的海藻酸鹽水凝膠對(duì)冰晶形成的影響以及低溫環(huán)境對(duì)海藻酸水凝膠微球結(jié)構(gòu)的影響，我們

6、發(fā)現(xiàn)在冷凍過程中海藻酸鹽水凝膠內(nèi)僅有少量的冰晶形成，且在復(fù)溫過程中沒有再結(jié)晶發(fā)生，這說明了海藻酸鹽水凝膠在一定程度上可以抑制冰晶的形成和再結(jié)晶的發(fā)生。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)蜏乇Ｗo(hù)劑濃度大于1M（滲透性）時(shí)，海藻酸鹽水凝膠微球的形態(tài)不會(huì)受到冷凍復(fù)溫的影響。在較低濃度的滲透性低溫保護(hù)劑(2M)存在時(shí)，形成的冰晶邊界多是尖銳的，而在高濃度的滲透性低溫保護(hù)劑(4M)或是在2M滲透性低溫保護(hù)劑和1.3M海藻糖存在時(shí)，形成的冰晶邊界多是圓潤(rùn)、光滑的。因

7、此，在低溫保存細(xì)胞等生物樣品時(shí)，糖的添加會(huì)大大提高保存效率。我們利用DSC方法檢測(cè)了海藻酸鹽水凝膠微球?qū)Σ煌瑵舛鹊蜏乇Ｗo(hù)劑結(jié)晶量的影響，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在較低濃度的低溫保護(hù)劑存在時(shí)，有海藻酸鹽水凝膠微球的會(huì)比沒有的結(jié)晶量少很多，這說明了這樣凝膠可以促進(jìn)水向玻璃化狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
　　為了解決低濃度保護(hù)劑玻璃化低溫保存過程中的再結(jié)晶等問題，我們探索了一種新的通過Fe3O4納米顆粒與微膠囊化海藻酸鹽水凝膠相結(jié)合的方法，成功實(shí)現(xiàn)了干細(xì)胞-海藻

8、酸鹽水凝膠構(gòu)建物的低濃度低溫保護(hù)劑下的玻璃化保存。在以往的細(xì)胞封裝保存過程中，大部分采用是單一的海藻酸鹽水凝膠結(jié)構(gòu)，而在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們采用了“核殼”結(jié)構(gòu)膠囊，外部的海藻酸鹽水凝膠外殼不僅可以保護(hù)細(xì)胞免受封裝時(shí)溶液剪切力的損傷，也避免細(xì)胞在復(fù)溫過程中冰晶的損傷，同時(shí)，這個(gè)外殼還可以把Fe3O4納米顆粒與細(xì)胞隔離開。在復(fù)溫過程中，海藻酸鹽水凝膠可以在一定程度上抑制再結(jié)晶的發(fā)生，同時(shí)，在交變電磁場(chǎng)下，保護(hù)劑溶液中的Fe3O4納米顆?？梢援a(chǎn)

9、生均勻熱量進(jìn)一步抑制局部以及整體溶液的再結(jié)晶或反玻璃化的發(fā)生。與傳統(tǒng)的復(fù)溫相比，這種納米復(fù)溫的方法把干細(xì)胞的貼壁效率從24％提高到68％，這對(duì)于其后期的應(yīng)用尤為重要。此外，這種納米復(fù)溫方法也確保了干細(xì)胞-水凝膠構(gòu)建物結(jié)構(gòu)的完整和3D培養(yǎng)中細(xì)胞的有效增殖。這種新的納米復(fù)溫方法對(duì)于促進(jìn)基于干細(xì)胞以及干細(xì)胞-水凝膠構(gòu)建物等應(yīng)用到臨床領(lǐng)域有著潛在的價(jià)值。
　　另外，為了排除生物實(shí)驗(yàn)過程中溶液滲透壓對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響以及更全面地檢測(cè)細(xì)胞活性，