Islet-1促M(fèi)SCs心肌特化過程中早期發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)分析.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建慢病毒Islet-1(Insulin gene enhancer binding protein isl-1，胰島素基因增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-1)表達(dá)載體，感染獲取自小鼠胚胎的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs) C3H10T1/2，誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞特異性向心肌細(xì)胞方向分化。檢測(cè)該過程中心肌早期發(fā)育相關(guān)基因Nkx2.5和Mef2c啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平的改變，分析明確高表達(dá)

2、Islet-1促M(fèi)SCs向心肌方向分化過程中表觀遺傳學(xué)DNA甲基化調(diào)控機(jī)制的作用。
　　材料與方法：
　　1.構(gòu)建Islet-1慢病毒表達(dá)載體:使用兩步PCR法(PCR-basedtwo-3tep DNA synthesis，PTDS)合成目的基因Islet-1序列片段，將目的基因片段與慢病毒載體pLenOR-THM分別進(jìn)行雙酶切。分別純化酶切產(chǎn)物，通過連接反應(yīng)將目的基因與pLenOR-THM載體連接。使用氯化鈣法制備細(xì)菌感

3、受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。挑取克隆菌落，小量抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行PCR反應(yīng)鑒定陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序并與目的基因序列比對(duì)分析，比對(duì)正確后進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提，獲得Islet-1-pLenOR-THM重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的Islet-1-pLenOR-THM重組質(zhì)粒及輔助包裝原件載體質(zhì)粒pMD2G、pRsv-REV、pMD1g-pRRE分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，四種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)Is

4、let-1慢病毒表達(dá)載體，收集上清液，濃縮后得到高滴度的目的慢病毒液。使用稀釋計(jì)數(shù)法檢測(cè)慢病毒載體滴度。
　　2.慢病毒載體感染C3H10T1/2細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)目為4×104/孔將C3H10T1/2細(xì)胞鋪于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度達(dá)60％時(shí)，分別向各孔中加入聚凝胺polybrene并使其最終濃度為8mg/L，按照病毒感染復(fù)數(shù)MOI=20向各孔內(nèi)加入相應(yīng)數(shù)量的慢病毒載體，培養(yǎng)24小時(shí)后更換為DMEM/F12完全培養(yǎng)基，72小時(shí)

5、后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)感染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Islet-1表達(dá)情況。
　　3.細(xì)胞分組:本實(shí)驗(yàn)包含三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，C3H10組（未經(jīng)處理的C3H10T1/2細(xì)胞，作為空白對(duì)照）、陰性對(duì)照組（感染慢病毒空載體的C3H10T1/2細(xì)胞）和實(shí)驗(yàn)組（感染Islet-1慢病毒表達(dá)載體的C3H10T1/2細(xì)胞）。
　　4.心肌早期發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平檢測(cè):感染慢病毒載體后2周，分別提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的基因組DN

6、A并檢測(cè)濃度，根據(jù)濃度計(jì)算重亞硫酸鹽處理過程中C3H10組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組基因組DNA的上樣體積，確保各組DNA的上樣量均為350ng。向各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的基因組DNA中加入重亞硫酸鹽試劑，以與重亞硫酸鹽試劑反應(yīng)后的DNA為模板進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng)，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并采集圖片。
　　結(jié)果：
　　1.Islet-1慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建:雙酶切后PCR鑒定的陽(yáng)性克隆，測(cè)序并與目的Islet-1序列比對(duì)結(jié)果顯示

7、Islet-1-pLenOR-THM重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。稀釋計(jì)數(shù)法檢測(cè)慢病毒載體滴度為2×108TU/mL。
　　2.慢病毒載體感染后5天，可觀察到陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有明顯的綠色熒光蛋白表達(dá);陰性對(duì)照組感染效率為90.09％，實(shí)驗(yàn)組感染效率為87.71％;慢病毒載體感染后4周，C3H10組和陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，實(shí)驗(yàn)組多個(gè)區(qū)域可見細(xì)胞排列相對(duì)緊密、趨向于同一方向，形態(tài)大致呈梭型;熒光顯微鏡下可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Islet-1