IL-6調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血淋巴細(xì)胞P-糖蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是高度致殘性自身免疫性疾病，目前 RA治療領(lǐng)域中的最大挑戰(zhàn)是改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）多藥耐藥性（MDR）的產(chǎn)生。ATP結(jié)合盒（ABC)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的藥物排出增加可能是多藥耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制，其中最典型的藥物排出機(jī)制即多藥耐藥基因1(MDR1)及其編碼的細(xì)胞膜表面P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)增加。
　　本課題為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)逆轉(zhuǎn)耐藥研究的系列研究之一，前期研究證實(shí)：
　　1.RA患者外周血

2、淋巴細(xì)胞P-gp的表達(dá)水平明顯增加，且與炎性指標(biāo)（血沉、C-反應(yīng)蛋白）及疾病活動(dòng)度（DAS28）相關(guān)，說明其參與了多藥耐藥的形成。
　　2.不同治療組P-gp表達(dá)水平的比較中，聯(lián)合用藥較單用藥P-gp表達(dá)水平減少，表明MTX/LFE周期聯(lián)合CTX一定程度逆轉(zhuǎn)P-gp表達(dá)。
　　3. IL-6刺激后，RA外周血淋巴細(xì)胞中P-gp的表達(dá)和功能均增強(qiáng)，且具有一定的時(shí)間依賴性及濃度依賴性。
　　P-gp的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，其中

3、，細(xì)胞因子的角色愈發(fā)受到重視。白介素-6（Interleukin-6, IL-6）作為一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，參與RA的全部致病過程。本課題前期研究已證明：1.RA患者外周血淋巴細(xì)胞上P-gp的表達(dá)水平明顯增加，且與炎性指標(biāo)（血沉、C-反應(yīng)蛋白）及疾病的活動(dòng)度（DAS28）相關(guān)。2. IL-6刺激后，RA患者外周血淋巴細(xì)胞上P-gp的表達(dá)和功能均增強(qiáng)，且具有一定的時(shí)間及濃度依賴性。那么，IL-6具體如何調(diào)控P-gp的表達(dá)，其具體信號(hào)通路是什

4、么？是本課題的科學(xué)問題。
　　細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用主要通過胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來介導(dǎo)。眾多研究表明，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中的角色愈發(fā)重要，其關(guān)鍵酶的特異性抑制劑也成為最有前途的靶向治療藥物之一。本課題即從研究較多的MAPK途徑和JAK-STAT途徑入手，探究IL-6調(diào)控RA患者外周血淋巴細(xì)胞 P-gp的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以明確IL-6對(duì)RA患者外周血淋巴細(xì)胞 P-gp的具體調(diào)控機(jī)制。
　　目的：通過不同

5、細(xì)胞通路抑制劑預(yù)處理后，加入IL-6共培養(yǎng)72h，觀察各組外周血淋巴細(xì)胞的mRNA合成水平、膜表面蛋白水平及其功能，明確炎癥細(xì)胞因子IL-6調(diào)控RA患者外周血淋巴細(xì)胞P-gp的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法：選取初治RA患者20例，用肝素抗凝管采集外周血標(biāo)本20ml,提取外周血淋巴細(xì)胞，建立外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，A組為空白對(duì)照組，在C、D組分別加入JAK2-STAT3通路抑制劑AG490(50uM)、ERK1/2通路抑制劑PD9805

6、9(20uM)進(jìn)行預(yù)處理。處理30min后，B、C、D組均加入IL-6，濃度2ng/ml,置于37℃ C02培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)，在72h收集細(xì)胞，RT-PCR的方法測(cè)外周血淋巴細(xì)胞 P-gp mRNA的合成，Western blot測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜上P-gp蛋白水平，羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞 P-gp的功能。分析不同通路抑制劑對(duì)IL-6調(diào)控RA外周血淋巴細(xì)胞 P-gp的影響。
　　結(jié)果：
　　1、

7、RT-PCR檢測(cè)各組外周血淋巴細(xì)胞P-gp mRNA水平：與空白對(duì)照組相比，IL-6組P-gp mRNA表達(dá)水平明顯升高；與IL-6組相比，AG490預(yù)處理+IL-6組與PD98059預(yù)處理+IL-6組的P-gp mRNA表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白對(duì)照組、AG490+IL-6組、PD98059+IL-6組兩兩比較組間無差異。
　　2、Western Blot檢測(cè)各組外周血淋巴細(xì)胞 p-gp蛋白水平:與空白對(duì)照組相比，

8、IL-6組外周血淋巴細(xì)胞膜表面P-gp蛋白水平明顯升高；與IL-6組相比，AG490預(yù)處理+IL-6組與PD98059預(yù)處理+IL-6組的外周血淋巴細(xì)胞膜表面P-gp蛋白水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白對(duì)照組、AG490+IL-6組、PD98059+IL-6組兩兩比較組間無差異。
　　3、Rh123蓄積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組外周血淋巴細(xì)胞P-gp的功能：與空白對(duì)照組相比，IL-6組Rh123蓄積量明顯減少，說明P-gp功能增強(qiáng)；與IL-

9、6組相比，AG490預(yù)處理+IL-6組與PD98059預(yù)處理+IL-6組的Rh123蓄積量均增加，說明P-gp功能減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白對(duì)照組、AG490+IL-6組、PD98059+IL-6組兩兩比較組間無差異。
　　結(jié)論：
　　1、炎性細(xì)胞因子IL-6刺激后，RA外周血淋巴細(xì)胞耐藥膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 P-gp mRNA合成水平、蛋白表達(dá)水平及功能均明顯增強(qiáng)。
　　2、ERKl／2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑PD98059及J