土撥鼠天然免疫分子RELA、ISG15的克隆及W12-6細胞中TLR信號通路的初步研究.pdf

1、目的：
　　土撥鼠模型被廣泛用于慢性乙型肝炎的發(fā)病機理(包括免疫發(fā)病機制)研究、抗病毒藥物及治療策略的評估。目前乙型肝炎病毒(HBV)感染的天然免疫應(yīng)答及TLR配體用于慢性乙肝治療是HBV研究領(lǐng)域的熱點問題。但土撥鼠天然免疫分子RelA和ISG15的序列尚未見報道。本研究對土撥鼠天然免疫分子RelA、ISG15以及內(nèi)參分子GAPDH進行了克隆和序列分析,同時研究了土撥鼠成纖維細胞系W12/6細胞在TLR1/TLR2、TLR3、TL

2、R4配體刺激下TLR信號通路相關(guān)分子的表達情況。
　　方法：
　　1.通過對比Genebank中人、豬、牛、小鼠、大鼠的RelA、ISG15和GAPDH序列,設(shè)計保守引物,提取土撥鼠W12/6細胞的總RNA作為模板,RT-PCR擴增獲得土撥鼠RelA、ISG15和GAPDH的cDNA序列。PCR產(chǎn)物純化后連接至T載體(pMD18-T),構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-mhRelA、pMD18-T-mhISG15和pMD18-T-

3、mhGAPDH。對重組質(zhì)粒進行PCR初篩及酶切鑒定,選擇陽性克隆測序。對所獲得的序列進行同源性和種系進化分析。
　　2.分別用TLR1/TLR2、TLR3、TLR4配體刺激W12/6細胞,在三小時、六小時、十二小時后分別提取細胞總RNA,Realtime-PCR分析TLRs信號通路中IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IFNβ、IL1β、IL6、ISG15和RelA的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.獲得土撥鼠Rel

4、A部分序列為1559bp,其中編碼序列為1481bp,編碼493個氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)該核苷序列與人RelA同源性最高,達89％,氨基酸序列則與人,豬,大鼠小鼠RelA同源性均較高,達85%。種系發(fā)生分析提示土撥鼠RelA與大鼠RelA的親緣關(guān)系最近。
　　2.獲得土撥鼠ISG15部分序列為370bp,均為編碼序列,編碼123個氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)該核苷序列與獼猴同源性最高,為78%,氨基酸序列則與人和獼猴ISG15同源性最高

5、,為69%。種系發(fā)生分析提示土撥鼠ISG15與人ISG15的親緣關(guān)系最近。
　　3.獲得土撥鼠GADPH序列為1214bp,其中編碼序列為1002bp,編碼334個氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)該核苷序列和氨基酸序列均與貓GAPDH的同源性最高,分別達93%和98%。種系發(fā)生分析亦提示土撥鼠GAPDH與穴兔GAPDH親緣關(guān)系最近。
　　4.在不同時間點檢測IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IFNβ、IL1β、IL6、ISG15

6、和RelA的表達情況發(fā)現(xiàn):
　　(1)用TLR1/2配體刺激W12/6細胞3小時后,僅IL1β表達較對照組略有升高(無統(tǒng)計學意義);刺激6小時后,除IL1β和IL6外,其余分子表達均較對照組有所升高;刺激12小時后,未檢測到表達高于對照組的分子。
　　(2)用TLR3配體刺激W12/6細胞3小時后,除IRF3、IRF5、IL1β、ISG15外,其余分子表達均較對照組有所升高;刺激6小時后,未檢測到表達高于對照組的分子;刺激1

7、2小時后,僅IRF5表達高于對照組。
　　(3)用TLR4配體刺激W12/6細胞3小時后,除IRF3和IRF5外,其余分子表達均較對照組有所升高;刺激6小時后,僅IRF1和IL6表達高于對照組;刺激12小時后,IRF1、IRF5、IRF7、IL1β、IL6、ISG15和RelA表達均高于對照組。
　　結(jié)論：
　　1.獲得土撥鼠RelA、ISG15分子cDNA序列,為土撥鼠模型用于天然免疫相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　2

8、.發(fā)現(xiàn)土撥鼠RelA、ISG15在核苷酸和氨基酸水平均與人的RelA和ISG15同源性較高,與我們之前對土撥鼠IFNAR、IL6、IL15等分子的研究結(jié)果類似。
　　3.TLR1/2、TLR3、TLR4的配體刺激能誘導W12/6細胞TLR信號相關(guān)分子的表達上調(diào),且W12/6細胞對不同配體刺激的應(yīng)答存在一定的時效性。
　　創(chuàng)新點：
　　1.獲得土撥鼠ISG15和RelA的部分序列以及GAPDH的全長序列。
　　2.