MagiC-TT介導(dǎo)干細胞靶向植入骨髓對細胞體內(nèi)分布和造血重建影響的研究.pdf

1、造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是指通過大劑量放射治療（簡稱放療）和化學(xué)治療（簡稱化療）預(yù)處理，清除受者原有的造血/免疫系統(tǒng)，再通過輸入自體或異體造血干細胞，使受者重建正常造血及免疫系統(tǒng)。
　　本課題組率先提出了磁力誘導(dǎo)細胞靶向移植(Magnetism-induced cell target transplantation，MagiC-TT)這一細胞治療新策

2、略并獲得國家基金（基金號:30901367）。MagiC-TT——首先使細胞獲得磁性，再在靶器官（如骨髓）局部短期施加一個適宜參數(shù)的磁場，磁化的細胞進入靶器官后，會被吸引在局部并定植下來，此時再撤去磁場，細胞可繼續(xù)增殖、分化或遷移至其它部位。MagiC-TT通過減少細胞遷移至靶組織的時間，以及增加供體細胞在靶器官的局部濃度來提高細胞植入的效率。
　　本課題分別采用HS/PCs和MSCs，研究MagiC-TT對干細胞靶向移植的作用。

3、
　　目的：
　　1、在體外，以Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化RFP-MSCs，比較研究磁化對RFP-MSCs生物學(xué)特性的影響;
　　2、在體內(nèi)，以MagiC-TT介導(dǎo)磁化RFP-MSCs植入小鼠骨髓，探討其骨髓靶向移植的效果及對RFP-MSCs在體內(nèi)分布與存活的影響;
　　3、在小鼠自體HSCT模型中，以MagiC-TT介導(dǎo)磁化HS/PCs靶向植入骨髓，探討其對造血重建的影響。
　　第一部分 Fe3

4、O4@PDA@Au納米顆粒磁化RFP-MSCs及MagiC-TT介導(dǎo)磁化細胞體外靶向遷移的研究
　　方法：(1)使用Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化紅熒光蛋白基因修飾的間充質(zhì)干細胞(red fluorescent protein gene modified mesenchymal stem cell，RFP-MSCs)，分選磁化細胞并測定細胞磁化陽性率;(2)比較研究磁化和野生型RFP-MSCs的細胞形態(tài)、增殖、分化及免疫表型

5、等，探討Fe3O4@PDA@Au納米顆粒的生物安全性和相容性;(3)探究在外加磁場條件下，磁化和野生型RFP-MSCs的細胞遷移（垂直、水平、逆重力遷移和生長的）能力;(4)體外分離小鼠股骨，分為磁化細胞組和對照組，分別注射經(jīng)新霉素耐藥基因和熒光素酶基因修飾的磁化RFP-MSCs(NeoR-Luc-RFP-MSCs)和未磁化的NeoR-Luc-RFP-MSCs，通過生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察兩組熒光細胞隨磁場位置變化而遷移的情況。
　　

6、結(jié)果：(1)Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化RFP-MSCs陽性率為（85.36±1.24）％。(2)磁化和野生型RFP-MSCs在細胞形態(tài)、增殖、分化及免疫表型方面無差異;納米顆粒位于RFP-MSCs細胞表面及細胞內(nèi);(3)在外加磁場條件下，磁化NeoR-Luc-RFP-MSCs具有定向遷移能力，而未磁化NeoR-Luc-RFP-MSCs則無;(4)通過生物發(fā)光成像系統(tǒng)，可觀察到磁化細胞組的NeoR-Luc-RFP-MSCs可隨著

7、磁場的位置移動。
　　小結(jié)：本部分實驗證明:Fe3O4@PDA@Au納米顆粒具有良好的生物安全性和相容性;在體外，MagiC-TT法可成功地實現(xiàn)磁化細胞的定向遷移及生長，為體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 MagiC-TT介導(dǎo)Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化的細胞對骨髓靶向移植的效果及對細胞體內(nèi)分布與存活的影響
　　方法：(1) NeoR-Luc-RFP-MSCs體內(nèi)實驗:野生型BALB/c小鼠隨機分為磁場組（M組

8、）和對照組（C組），每組4只，分別經(jīng)股骨注射磁化的NeoR-Luc- RFP-MSCs，使用生物發(fā)光儀觀察兩組小鼠體內(nèi)熒光在不同時間點的變化;(2)RFP-MSCs體內(nèi)實驗:20只增強綠色熒光蛋白(enhanced Green FluorescentProtein，eGFP)轉(zhuǎn)基因C57BL/6雌性小鼠，均隨機分為M組和C組（每組10只），在X線引導(dǎo)下股骨穿刺，向兩組小鼠股骨骨髓腔中注射經(jīng)Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化的RFP-M

9、SCs，但分別加與不加磁場（M組和C組）;通過流式細胞術(shù)、熒光定量PCR、病理切片和自創(chuàng)的半固體脫鈣(semi-solid decalcification，SSD)技術(shù)，研究細胞在體內(nèi)的骨髓靶向移植效果，以及細胞在體內(nèi)的分布和存活。
　　結(jié)果：(1)小動物活體成像儀結(jié)果顯示，在細胞注射后5 min時，C組的RFP-MSCs在肺臟開始聚集，股骨處熒光逐漸減弱;而M組的熒光可局限在小鼠的股骨處，若在固定磁場1h后撤去磁場，5 min后

10、M組小鼠肺臟出現(xiàn)熒光，15 min時熒光達到高峰;(2)普通冰凍切片、流式細胞術(shù)、熒光定量PCR和SSD技術(shù)觀察結(jié)果顯示，M組的骨髓中可見大量的RFP-MSCs;而C組小鼠骨髓中則很少見到RFP-MSCs，細胞主要分布在肺、肝、脾等臟器中;(3)病理技術(shù)尤其是SSD處理后的病理學(xué)檢查，清晰地顯示了移植后骨髓內(nèi)紅/綠熒光細胞（即供、受者細胞）的位置、形態(tài)及相互作用關(guān)系等;(4)磁化的RFP-MSCs可以在兩組小鼠不同的器官和組織中存活至少

11、3個月。
　　小結(jié)：本部分實驗表明:(1)在M組小鼠體內(nèi)，MagiC-TT法可成功地實現(xiàn)磁化RFP-MSCs的靶向遷移，而在早期撤去M組小鼠的磁場后，磁化細胞可在體內(nèi)遷移;(2) RFP-MSCs在C組小鼠體內(nèi)主要分布在肺、肝、脾等臟器中，骨髓中分布較少;(3)磁化細胞在小鼠體內(nèi)未見明顯毒性，可在體內(nèi)長期存活。
　　第三部分 MagiC-TT法介導(dǎo)造血干/祖細胞在小鼠自體HSCT模型中促進造血重建的研究
　　方法：(1

12、)移植細胞數(shù)量梯度實驗:60只C57BL/6受者雌性小鼠，隨機分為6組，每組10只小鼠，分別經(jīng)股骨移植（5×106、1×106，1×105的3個梯度）和尾靜脈移植（5×106、1×106，1×105的3個梯度）造血干/祖細胞。各組小鼠移植前經(jīng)7.5 Gy直線加速器進行清髓性放療，觀察各組生存率等，確定后續(xù)使用的移植細胞數(shù)量。(2)造血干/祖細胞股骨靶向移植實驗:34只C57BL/6雌性普通小鼠作為受者，隨機分為2組，每組17只，兩組小鼠

13、經(jīng)7.5 Gy清髓性放療后，分別于右側(cè)骨髓腔中輸注0.02 ml經(jīng)磁化的來源于GFP C57BL/6小鼠的造血干/祖細胞懸液(1×106)/只，并分別于右側(cè)股骨外加磁場（M組）或不加磁場（C組），一定時間后撤去。流式細胞術(shù)檢測細胞輸注后不同時間點(0h、24 h、72 h)處死的兩組小鼠（各3只），比較左右股骨中GFP+細胞數(shù)量和比例有無統(tǒng)計學(xué)差異;觀察兩組剩余小鼠（每組8只）的一般情況、血常規(guī)變化、外周血GFP+細胞嵌合率等，并使用病

14、理切片、SSD、熒光定量PCR法等探究GFP+細胞的體內(nèi)分布等。
　　結(jié)果：(1)移植細胞數(shù)量梯度實驗:尾靜脈移植組，輸注5×106個細胞的小鼠6/10只存活，輸注1×106和1×105個細胞的小鼠均死亡;而股骨移植組中，輸注5×106個細胞的小鼠均存活，輸注1×106個細胞的小鼠2只存活，1×105的小鼠均死亡;根據(jù)實驗結(jié)果，以后實驗中每只小鼠移植1×106個細胞。(2)造血干/祖細胞股骨靶向移植實驗:①M組和C組小鼠于清髓性放

15、療后體重進行性下降，精神狀態(tài)欠佳，1周后部分小鼠體重、精神、活動逐漸恢復(fù)。②2組小鼠的生存情況分別為:M組7/8小鼠的生存時間＞30d;而C組小鼠30d時存活1/8只，平均生存時間（12.43±5.13）d，兩組小鼠生存有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。③兩組小鼠造血基本恢復(fù)時，外周血中GFP+比例分別為(94.10±1.97)％和93.82％，表明HSCT造血重建成功。④細胞輸注后0h、24 h、72 h，流式檢測兩組小鼠左右股骨中GFP

16、+造血干/祖細胞結(jié)果顯示:a.組內(nèi)比較:M組小鼠各時間點股骨中GFP+細胞比例，均是注射細胞側(cè)股骨多于對側(cè)股骨(P0h=0.040，P24h=0.030，P72h=0.049);而C組各時間點的GFP+細胞比例在注射細胞側(cè)與對側(cè)股骨無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0h=0.184，P24h=0.184，P72h=0.368)。b.組間比較:注射細胞側(cè)股骨中的GFP+細胞比例，M組小鼠在三個時間點均多于C組，且有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0h=0.007，P

17、24h=0.006，P72h=0.036);而比較M組和C組的對側(cè)股骨GFP+細胞比例則無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0h=1.000，P24h=0.083，P72h=0.108)。
　　小結(jié)：本部分實驗采用eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因HSCT的模型，探討了MagiC-TT對小鼠移植后造血恢復(fù)的影響。結(jié)果表明MagiC-TT能夠?qū)崿F(xiàn)磁化造血干/祖細胞的股骨靶向移植，可縮短移植后小鼠造血恢復(fù)時間，提高了生存率。
　　結(jié)論：