PSMAe-p驅(qū)動shRNA靶向干擾的細(xì)胞特異性及Tf-PEG-PEI基因轉(zhuǎn)移能力的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
   在選定核干因子(NS)作為“靶基因”的基礎(chǔ)上,應(yīng)用RNA干擾技術(shù),通過建立一種能夠在體內(nèi)和體外將干擾質(zhì)粒有效、靶向?qū)肭傲邢侔┘?xì)胞的非病毒載體系統(tǒng),并使干擾片斷在前列腺癌細(xì)胞中特異性表達,沉默特定癌基因,從而為治療前列腺癌提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
   方法:
   通過構(gòu)建靶向基因轉(zhuǎn)移非病毒載體Tf-PEG-PEI,分別以PEI和Tf-PEG-PEI將pEGFP-C1質(zhì)粒及構(gòu)建的以PSMAe/p為

2、驅(qū)動序列的EGFP干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)高表達PSMA的人前列腺癌細(xì)胞系LNCap中,通過熒光顯微鏡觀察各組熒光表達,并應(yīng)用實時定量PCR(real time PCR)和western blot檢測EGFP基因和蛋白表達變化,并以不表達PSMA的人前列腺癌細(xì)胞系PC-3、不表達PSMA的人膀胱癌細(xì)胞系T24及人胚腎HEK293進行對照實驗,從而證實PSMAe/p驅(qū)動干擾片斷的細(xì)胞特異性和Tf-PEG-PEI高效靶向基因轉(zhuǎn)移的能力。以功能基

3、因shNS更換EGFP干擾質(zhì)粒pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)質(zhì)粒中的shEGFP,重構(gòu)針對NS的干擾質(zhì)粒,利用LNCaP及PC-3進行細(xì)胞實驗,以Tf-PEG-PEI為載體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞,檢測細(xì)胞的形態(tài)、生長情況以及NS基因和蛋白的變化,進一步證實PSMAe/p驅(qū)動干擾片斷的細(xì)胞特異性及Tf-PEG-PEI的高效基因轉(zhuǎn)移能力。從而為后續(xù)的研究提供必要的體外細(xì)胞實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
   結(jié)果:
   熒光

4、顯微鏡測定結(jié)果顯示:干擾質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞后,分別以PEI及Tf-PEG-PEI為載體的干擾組熒光表達均有不同程度減少,與空載體組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。干擾組中EGFP mRNA和蛋白表達與對照組相比均有不同程度下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。干擾質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC-3、T24和HEK293細(xì)胞后各組熒光表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),EGFP mRNA和蛋白表達水平

5、無差異;以PEI為載體組和轉(zhuǎn)染相同質(zhì)粒以Tf-PEG-PEI為載體組對比,熒光表達及EGFP mRNA和蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),但Tf-PEG-PEI為載體組細(xì)胞形態(tài)較好,存活率較高,轉(zhuǎn)染效率稍高。前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3中均表達NS蛋白;在將干擾質(zhì)粒pPSMAe/p-shNS-poly(A)轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞后NS基因表達水平下調(diào),細(xì)胞增大,胞膜邊緣突起增多,更趨向于分化;S期細(xì)胞的百分率降低,G1期的百分率

6、升高;細(xì)胞的體外增殖速率明顯降低。在PC-3細(xì)胞中NS基因表達無明顯下調(diào),細(xì)胞周期和增殖能力無明顯變化。
   結(jié)論:
   Tf-PEG-PEI具有高效靶向基因轉(zhuǎn)移的能力,可將體外的基因片段高效轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)細(xì)胞中,且經(jīng)PEG修飾后細(xì)胞毒性大大降低,是一個安全、高效、的RNA干擾輸送系統(tǒng)。PSMAe/p能在高表達PSMA的LNCaP細(xì)胞中特異性驅(qū)動shRNA轉(zhuǎn)錄,而在不表達PSMA的PC-3細(xì)胞、T24細(xì)胞和HEK293

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