PSMAe-p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾的細(xì)胞特異性及Tf-PEG-PEI基因轉(zhuǎn)移能力的研究.pdf

1、目的:
　　 在選定核干因子（NS）作為“靶基因”的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)建立一種能夠在體內(nèi)和體外將干擾質(zhì)粒有效、靶向?qū)肭傲邢侔┘?xì)胞的非病毒載體系統(tǒng)，并使干擾片斷在前列腺癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，沉默特定癌基因，從而為治療前列腺癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 通過(guò)構(gòu)建靶向基因轉(zhuǎn)移非病毒載體Tf-PEG-PEI，分別以PEI和Tf-PEG-PEI將pEGFP-C1質(zhì)粒及構(gòu)建的以PSMAe/p為

2、驅(qū)動(dòng)序列的EGFP干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)高表達(dá)PSMA的人前列腺癌細(xì)胞系LNCap中，通過(guò)熒光顯微鏡觀察各組熒光表達(dá)，并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（real time PCR）和western blot檢測(cè)EGFP基因和蛋白表達(dá)變化，并以不表達(dá)PSMA的人前列腺癌細(xì)胞系PC-3、不表達(dá)PSMA的人膀胱癌細(xì)胞系T24及人胚腎HEK293進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，從而證實(shí)PSMAe/p驅(qū)動(dòng)干擾片斷的細(xì)胞特異性和Tf-PEG-PEI高效靶向基因轉(zhuǎn)移的能力。以功能基

3、因shNS更換EGFP干擾質(zhì)粒pPSMAe/p-shEGFP-poly（A）質(zhì)粒中的shEGFP，重構(gòu)針對(duì)NS的干擾質(zhì)粒，利用LNCaP及PC-3進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以Tf-PEG-PEI為載體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)情況以及NS基因和蛋白的變化，進(jìn)一步證實(shí)PSMAe/p驅(qū)動(dòng)干擾片斷的細(xì)胞特異性及Tf-PEG-PEI的高效基因轉(zhuǎn)移能力。從而為后續(xù)的研究提供必要的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果:
　　 熒光

4、顯微鏡測(cè)定結(jié)果顯示：干擾質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞后，分別以PEI及Tf-PEG-PEI為載體的干擾組熒光表達(dá)均有不同程度減少，與空載體組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。干擾組中EGFP mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均有不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干擾質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC-3、T24和HEK293細(xì)胞后各組熒光表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），EGFP mRNA和蛋白表達(dá)水平

5、無(wú)差異；以PEI為載體組和轉(zhuǎn)染相同質(zhì)粒以Tf-PEG-PEI為載體組對(duì)比，熒光表達(dá)及EGFP mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但Tf-PEG-PEI為載體組細(xì)胞形態(tài)較好，存活率較高，轉(zhuǎn)染效率稍高。前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3中均表達(dá)NS蛋白；在將干擾質(zhì)粒pPSMAe/p-shNS-poly（A）轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞后NS基因表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞增大，胞膜邊緣突起增多，更趨向于分化；S期細(xì)胞的百分率降低，G1期的百分率

6、升高；細(xì)胞的體外增殖速率明顯降低。在PC-3細(xì)胞中NS基因表達(dá)無(wú)明顯下調(diào)，細(xì)胞周期和增殖能力無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 Tf-PEG-PEI具有高效靶向基因轉(zhuǎn)移的能力，可將體外的基因片段高效轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)細(xì)胞中，且經(jīng)PEG修飾后細(xì)胞毒性大大降低，是一個(gè)安全、高效、的RNA干擾輸送系統(tǒng)。PSMAe/p能在高表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞中特異性驅(qū)動(dòng)shRNA轉(zhuǎn)錄，而在不表達(dá)PSMA的PC-3細(xì)胞、T24細(xì)胞和HEK293