G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向缺血再灌注損傷腎臟歸巢并促進(jìn)腎臟修復(fù)的研究.pdf

1、目的：本研究擬通過腎臟缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的研究，探討骨髓來源的干細(xì)胞在急性腎臟損傷修復(fù)中的作用，觀察骨髓來源的干細(xì)胞能否分化為腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，深化對(duì)干細(xì)胞可塑性的認(rèn)識(shí)；觀察骨髓干細(xì)胞是否可以轉(zhuǎn)化為腎祖細(xì)胞，明確腎祖細(xì)胞的來源；觀察粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是否可以有效動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血并向缺血再灌注損傷腎臟歸巢，提高腎臟修復(fù)的效能，為急性腎臟損傷的治療探索新方法。
　　 方法：6周齡全身表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的

2、C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠提供骨髓，6-8周齡同種無熒光標(biāo)記的C57BL/6J小鼠20只作為骨髓受體。在接受骨髓移植前，所有受體小鼠接受致死劑量的γ放射線137Cs照射(放射劑量為8.5Gy)，照射結(jié)束后2小時(shí)內(nèi)靜脈注射2×105骨髓單個(gè)核細(xì)胞。接受骨髓移植5周后，嵌合體小鼠骨髓重建情況經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)確認(rèn)。待骨髓重建完畢后(移植后第6周)所有小鼠均結(jié)扎左側(cè)腎蒂30min后再開放，建立缺血再灌注動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組：(1)生理鹽水

3、對(duì)照組(n=10)：缺血再灌注手術(shù)前3天至術(shù)后4天，皮下注射生理鹽水，0.2ml/d。(2)G-CSF動(dòng)員組(n=10)：缺血再灌注手術(shù)前3天至術(shù)后4天，皮下注射人重組粒細(xì)胞集落刺激因子200μg/kg/d。動(dòng)員結(jié)束后第1天取外周血通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sca-1、c-Kit、CD34陽性的干細(xì)胞占外周血非紅系細(xì)胞的比例。缺血損傷再灌注損傷1周后取腎臟標(biāo)本行HE染色，采用Vyacheslav等的半定量方法評(píng)估腎小管損傷程度。觀察動(dòng)員組與對(duì)照

4、組腎臟病理損傷程度的差異。用膠原酶將腎臟消化為單個(gè)細(xì)胞通過對(duì)Sca-1、c-Kit、CD34等不同干細(xì)胞抗原標(biāo)志物進(jìn)行熒光染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較兩組腎臟中干細(xì)胞含量的差異。缺血再灌注損傷4周后通過組織切片熒光組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等方法觀察骨髓來源的干細(xì)胞在腎臟內(nèi)的分化情況，通過統(tǒng)計(jì)腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量以及骨髓來源的腎祖細(xì)胞數(shù)量來驗(yàn)證G-CSF動(dòng)員組與對(duì)照組在腎臟損傷修復(fù)方面的差異。
　　 結(jié)果：G-CSF動(dòng)員后，外周血流式細(xì)

5、胞儀檢測(cè)顯示，分別為Sca-1、c-Kit、CD34陽性的三群干細(xì)胞占外周血非紅系細(xì)胞的比例(3.16％±0.11％、3.78％±0.08％、6.09％±0.13％)均高于對(duì)照組(1.67％±0.10％、2.19％±0.06％、2.85％±0.14％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺血再灌注損傷1周后，腎臟細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，G-CSF動(dòng)員組的缺血側(cè)腎臟中，骨髓來源并且分別表達(dá)Sca-1、c-Kit、CD34的干細(xì)胞(GFP和

6、干細(xì)胞抗原表達(dá)雙陽性)的比例(0.86％±0.05％、0.78％±0.11％、0.90％±0.08％)均高于對(duì)照組(0.51％±0.06％、0.47％±0.08％、0.43％±0.03％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)動(dòng)員組的缺血側(cè)腎臟中骨髓來源GFP陽性細(xì)胞的百分比(13.05％±1.14％)也明顯高于對(duì)照組(7.75％±0.58％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺血再灌注損傷4周后的腎臟組織切片經(jīng)CD31、SMA、S

7、ca-1免疫熒光染色，可見骨髓來源的干細(xì)胞出現(xiàn)在腎小管間隙和腎小球血管簇，并分化為CD31或SMA陽性的腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與損傷后血管新生。在損傷區(qū)域的腎小管中出現(xiàn)骨髓來源表達(dá)GFP綠色熒光的細(xì)胞，骨髓來源的細(xì)胞可以分化為腎小管上皮細(xì)胞，參與了腎小管損傷的修復(fù)。在腎臟間質(zhì)中還可以觀察到GFP和Sca-1雙陽性的骨髓來源的腎祖細(xì)胞。通過對(duì)比G-CSF動(dòng)員組和對(duì)照組的腎臟，發(fā)現(xiàn)動(dòng)員組在缺血缺血再灌注損傷1周后腎小管損傷程度評(píng)分分值(1.4

8、6±0.05)明顯低于對(duì)照組(2.32±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。損傷4周后G-CSF動(dòng)員組的腎臟中表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志CD31的細(xì)胞數(shù)目(31.30±0.42)高于生理鹽水對(duì)照組(20.05±0.58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過對(duì)骨髓來源的腎祖細(xì)胞的計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)G-CSF動(dòng)員組中GFP與Sca-1雙陽性的細(xì)胞數(shù)(6.00±0.82)多于對(duì)照組(3.50±0.58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。