骨橋蛋白對β1,4GalT-Ⅰ表達的影響及在細胞間黏附作用的相關性研究.pdf

1、目的:探究β1，4半乳糖基轉移酶-1(β1，4GalT-Ⅰ)和骨橋蛋白(OPN)在圍著床期小鼠子宮內膜的表達規(guī)律;分析OPN和β1，4GalT-Ⅰ在人體子宮內膜的表達、定位情況;檢測人OPN重組蛋白(rhOPN)在模擬著床期子宮內膜RL95-2細胞中對β1，4GalT-Ⅰ表達的影響;分析rhOPN蛋白調節(jié)β1，4GalT-Ⅰ表達時所涉及的相關通路分子;檢測rhOPN蛋白和β1，4GalT-ⅠsiRNA分別調控體外胚胎著床模型中子宮內膜β

2、1，4GalT-Ⅰ的表達和對胚胎與子宮內膜黏附的影響。
　　 方法:建立小鼠早孕模型，收取圍著床期妊娠小鼠(D1-D5)子宮內膜，分別提取子宮內膜蛋白和RNA，用Real-timePCR和Western-blot檢測圍著床期小鼠子宮內膜中β1，4GalT-Ⅰ和OPN的表達情況;采集臨床增生期、分泌期子宮內膜標本，分析OPN和β1，4GalT-Ⅰ在人體子宮內膜的定位情況;采用人子宮內膜癌細胞(RL95-2)模擬著床前接受態(tài)子宮內膜

3、，通過rhOPN蛋白刺激RL95-2細胞，采用Real-timePCR和Western-blot方法檢測不同濃度、不同時間條件下rhOPN蛋白對β1，4GalT-Ⅰ表達的影響，并確定最佳rhOPN作用條件（時間，濃度）;在最佳條件下，檢測參與rhOPN蛋白對β1，4GalT-Ⅰ調控表達的相關信號通路，并采用相關信號分子的特異性抑制劑，通過Real-timePCR和Western-blot方法檢驗相關信號通路;利用人源的絨毛癌細胞(JAR

4、)模擬胚泡與RL95-2細胞組成體外著床模型，用β1，4GalT-ⅠsiRNA干擾RL95-2細胞中β1，4GalT-Ⅰ的表達，通過活細胞熒光標記JAR細胞，分別通過熒光顯微鏡和流式細胞計數分析β1，4GalT-Ⅰ表達下調后，rhOPN蛋白對RL95-2細胞和JAR細胞間黏附的影響。
　　 結果:在圍著床期小鼠(D1-D5)子宮內膜中，OPN和β1，4GalT-Ⅰ在蛋白和RNA水平的表達呈現一致性，D1-D4逐漸升高，在妊娠第4

5、天（D4;著床窗口期）達到峰值，然后在孕D5下降。
　　 免疫組織化學結果顯示，OPN和β1，4GalT-Ⅰ在人子宮內膜組織腺體周圍表達，且分泌期表達強于增生期。
　　 不同濃度，不同時間條件下，rhOPN蛋白刺激RL95-2細胞表達β1，4GalT-Ⅰ逐漸增強，在200ng/ml、2h時β1，4GalT-Ⅰ的表達最強;選擇rhOPN最佳作用條件，檢測參與增強β1，4GalT-Ⅰ表達的相關信號通路分子，發(fā)現在rhOPN蛋

6、白刺激下，Erk1/2、AKT(thr308)、p38的活化和IκBα的降解均增強;分別加入以上4種通路分子的特異性抑制劑后發(fā)現當Erk1/2、AKT、NF-κB的活性受到抑制時，rhOPN蛋白對β1，4GalT-Ⅰ的表達上調作用均受到不同程度的抑制，而抑制p38活性時，rhOPN蛋白對β1，4GalT-Ⅰ的表達并無影響;
　　 在體外細胞黏附實驗中，與未處理組相比，rhOPN蛋白能夠提高RL95-2細胞對JAR細胞的黏附率。當

7、用β1，4GalT-ⅠsiRNA下調RL95-2細胞中β1，4GalT-Ⅰ的表達后，JAR細胞在RL95-2細胞上的粘附率下降。下調β1，4GalT-Ⅰ后再加入rhOPN蛋白，JAR細胞的黏附率升高且與未處理組相比無明顯差別。
　　 結論:β1，4GalT-Ⅰ和OPN在圍著床期小鼠子宮內膜的表達相似性，且均在分泌期子宮內膜腺體中高表達，提示β1，4GalT-Ⅰ和OPN共同參與了胚胎著床的過程;
　　 OPN可能通過活化E