Poly(I-C)激活TLR3抑制馬立克氏病毒感染及誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡的機(jī)制.pdf

1、Toll樣受體家族(Toll-like receptor family)是一類典型的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)，能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)并激活下游相關(guān)信號(hào)通路，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。Toll受體3(Toll-like receptor3，TLR3)是TLR家族中的重要成員，在抗病毒固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重

2、要作用。TLR3識(shí)別病毒感染產(chǎn)生的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)結(jié)構(gòu)后，通過(guò)Myd88非依賴性途徑，激活I(lǐng)RF3和NF-κB，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和促炎性細(xì)胞因子的生成，抑制病毒的復(fù)制，限制感染的進(jìn)一步擴(kuò)散。研究表明，TLR3信號(hào)通路在抗皰疹病毒感染以及抗腫瘤免疫中起著不可替代的作用。
　　馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)是一種α亞科皰疹病毒，可引起以T細(xì)胞淋巴瘤和免

3、疫抑制為主要臨床特征的雞馬立克氏病(Marek's disease，MD)，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。MDV致病毒株感染雞通常要?dú)v經(jīng)四個(gè)階段，即早期溶細(xì)胞感染階段、潛伏期階段、晚期溶細(xì)胞感染階段和轉(zhuǎn)化階段。轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在MDV感染的4個(gè)不同階段中，脾臟、法氏囊、胸腺等免疫器官中TLR3信號(hào)通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平都出現(xiàn)了顯著性變化。尤其是在晚期溶細(xì)胞感染和腫瘤轉(zhuǎn)化階段，TLR3信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)受到了明顯的抑制，暗示該信號(hào)通路

4、是宿主抗MDV免疫反應(yīng)的一個(gè)重要組成部分。近期的研究結(jié)果表明，激活TLR3應(yīng)答不僅能在體外有效抑制MDV的復(fù)制，同時(shí)也能夠明顯抑制體內(nèi)MD腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是TLR3信號(hào)通路如何抑制MDV感染和腫瘤生成，目前尚不清楚。
　　本研究主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等研究方法，探索了激活TLR3信號(hào)通路對(duì)MDV感染的雞胚成纖維細(xì)胞以及MDV轉(zhuǎn)化的雞T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的影響及其分子機(jī)制，為解釋TLR3在宿主抗MDV免疫應(yīng)答中作用提

5、供了重要線索和數(shù)據(jù)。
　　1.Poly(I∶C)抑制MDV感染的機(jī)制
　　本研究通過(guò)在MDV感染CEF后不同時(shí)間點(diǎn)激活TLR3信號(hào)通路，探究TLR3應(yīng)答對(duì)MDV不同復(fù)制階段的抑制效果。研究結(jié)果表明，MDV感染后的任意時(shí)間點(diǎn)激活TLR3均能有效降低MDV的病毒滴度和gB基因的轉(zhuǎn)錄水平。Real-time PCR檢測(cè)顯示poly(I∶C)處理后，MDV感染細(xì)胞中TLR3信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平顯著提高，其中TLR3、IRF3和

6、IKKα的上調(diào)表達(dá)水平最為顯著。同時(shí)IFN-β、IL-6和TNF-α等下游效應(yīng)分子也出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)表達(dá)。我們又使用小分子抑制劑BX795和Resveratrol分別抑制TLR3介導(dǎo)的IRF3和NF-κB活化，探究Ⅰ型干擾素和促炎性細(xì)胞因子對(duì)MDV感染的影響。結(jié)果顯示，10μMBX795和100μM Resveratrol可分別有效抑制TLR3介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素和促炎性細(xì)胞因子合成，且不顯著影響細(xì)胞活性。對(duì)于已感染MDV的CEF，無(wú)論是10

7、μM BX795還是100μMResveratrol都只能削弱但不能完全廢除TLR3激活對(duì)MDV感染的抑制效果。這表明TLR3信號(hào)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素和促炎性細(xì)胞因子均能在體外有效抑制MDV的感染。
　　2.Poly(I∶C)特異性誘導(dǎo)MD腫瘤細(xì)胞系MSB1凋亡
　　若干研究表明，dsRNA不僅能激活固有免疫，同時(shí)也可通過(guò)不同的作用機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。MSB1細(xì)胞系是一種由MD腫瘤衍生而來(lái)的雞T淋巴瘤細(xì)胞系，但dsRN

8、A能否誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡還未見(jiàn)報(bào)道。本研究使用合成的dsRNA類似物poly(I∶C)刺激MSB1細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等多種方法檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。結(jié)果顯示，poly(I∶C)刺激能夠?qū)е翸SB1細(xì)胞的死亡而不引起包括DF-1、CEF、CEK、HD11以及DT40等在內(nèi)的其他禽源傳代細(xì)胞系或原代細(xì)胞死亡，同時(shí)MSB1細(xì)胞的死亡數(shù)量與poly(I∶C)終濃度和刺激時(shí)間呈顯著正相關(guān)。poly(I∶C)刺激后的

9、MSB1細(xì)胞出現(xiàn)崩解，折光性下降，與凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化相似。隨后的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，poly(I∶C)刺激組MSB1細(xì)胞的AnnexinV陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，證明poly(I∶C)刺激引起了MSB1細(xì)胞的凋亡。與此同時(shí)，poly(I∶C)刺激后，MSB1細(xì)胞中Caspase3/7、8、9活性較對(duì)照組都有極顯著的上調(diào)，進(jìn)一步確認(rèn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。JC-1染色結(jié)果證實(shí)MSB1細(xì)胞經(jīng)poly(I∶C)處理后出現(xiàn)線粒體膜電位丟失

10、，與Caspase9活性增強(qiáng)的結(jié)果相一致，暗示內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑的激活?；蚪MDNA電泳分析結(jié)果顯示，poly(I∶C)刺激后的MSB1細(xì)胞基因組出現(xiàn)凋亡特征性DNA ladder，驗(yàn)證了Caspase3的激活和凋亡的發(fā)生。而泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可完全抑制poly(I∶C)誘導(dǎo)的MSB1細(xì)胞凋亡。綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)TLR3配體poly(I∶C)可通過(guò)Caspase依賴性途徑特異性誘導(dǎo)MD腫瘤細(xì)胞系MSB1的凋亡

11、，這一結(jié)果暗示poly(I∶C)可用于MD的防治和淋巴瘤的治療。
　　3.Poly(I∶C)誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　TLR3信號(hào)通路已被證實(shí)可以通過(guò)多種方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。前期研究結(jié)果顯示TLR3配體poly(I∶C)能夠特異性誘導(dǎo)MD腫瘤細(xì)胞系MSB1凋亡。本研究通過(guò)小分子抑制劑、流式細(xì)胞術(shù)、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、real-time PCR等技術(shù)手段，探究TLR3信號(hào)通路在poly(I∶C)誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡中的

12、作用。首先，real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，poly(I∶C)誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，接頭分子TLR3、TRIF、TRAF6、RIP1、TANK、IKKα以及促凋亡分子Bak、p53、Fas等均出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，IFN-β和TNF-α也出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的顯著上調(diào)表達(dá)，證明TLR3信號(hào)通路與poly(I∶C)誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。隨后，我們使用小分子抑制劑Pepinh-TRIF、BX795和Resveratrol對(duì)TLR3

13、信號(hào)通路的不同接頭分子進(jìn)行阻斷，探究TLR3信號(hào)通路在poly(I∶C)誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制。經(jīng)過(guò)摸索，50μM Pepinh-TRIF、10μM BX795和50μM Resveratrol可分別有效阻斷MSB1細(xì)胞中接頭分子TRIF、IRF3和NF-κB的活化，且對(duì)MSB1細(xì)胞活性沒(méi)有明顯影響。接著我們將MSB1細(xì)胞用上述抑制劑進(jìn)行處理，然后再用poly(I∶C)加以刺激。結(jié)果顯示，50μMPepinh-TRIF和5

14、0μM Resveratrol均可顯著抑制poly(I∶C)刺激引起的細(xì)胞死亡，且AnnexinⅤ陽(yáng)性細(xì)胞比例和Caspase活性也都出現(xiàn)顯著下降;而10μM BX795對(duì)poly(I∶C)誘導(dǎo)的MSB1細(xì)胞凋亡沒(méi)有任何抑制作用。綜上所述，TLR3信號(hào)通路中的接頭分子的TRIF和NF-κB對(duì)poly(I∶C)誘導(dǎo)MSB1細(xì)胞凋亡是不可或缺的。本研究結(jié)果初步闡明了poly(I∶C)通過(guò)TLR3信號(hào)通路觸發(fā)MSB1細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，進(jìn)一步