炎性因子Interleukin-6和新型轉(zhuǎn)錄本環(huán)狀RNA在卵巢衰老中的作用初探.pdf

1、目的：
　　1、探討IL-6在小鼠和人卵巢衰老過程中的表達(dá)變化，以及IL-6對小鼠卵泡發(fā)育成熟的影響，初步探究其分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，探索IL-6信號(hào)通路抑制劑托珠單抗能否提高年老小鼠卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，改善老年小鼠的卵母細(xì)胞質(zhì)量，從而為提高高齡婦女的生育結(jié)局提供新的策略和治療方法。
　　2、探索新型轉(zhuǎn)錄本環(huán)狀RNA在女性顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其在衰老中變化，揭示與卵巢儲(chǔ)備和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降有關(guān)的環(huán)狀RNA。
　　材

2、料與方法：
　　1、ELISA、免疫化學(xué)和蛋白免疫印記分析 IL-6在不同年齡階段小鼠和人卵巢組織中的表達(dá)變化；基于卵泡三維培養(yǎng)體系，用不同濃度的IL-6處理小鼠竇前卵泡，觀察IL-6對卵泡直徑增長的影響，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測雌孕激素生成，通過qRT-PCR、免疫熒光、體外成熟以及電鏡評估其對卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的作用，TUNEL和蛋白免疫印記等檢測凋亡、自噬相關(guān)蛋白和信號(hào)分子表達(dá)。利用卵巢間質(zhì)細(xì)胞與卵泡共培養(yǎng)體系，將托珠單抗加入年老

3、小鼠卵巢間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中，觀察其對卵泡發(fā)育成熟的影響；用不同濃度的托珠單抗處理9月齡生殖衰老小鼠，1個(gè)月后檢測小鼠卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，免疫熒光觀察卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，MitoTracker檢測卵母細(xì)胞線粒體分布，ELISA檢測血清AMH、雌激素和孕酮的水平，蛋白免疫印記技術(shù)檢測凋亡蛋白、自噬相關(guān)蛋白及JAK/STAT3的表達(dá)。
　　2、收集2015年1月到2015年8月期間在同濟(jì)醫(yī)院生殖中心進(jìn)行體外受精—胚胎移植患者的顆粒細(xì)胞

4、，共126例。通過芯片檢測人顆粒細(xì)胞中環(huán)狀RNA表達(dá)模式隨年齡的變化，qRT-PCR在20對樣品中驗(yàn)證差異表達(dá)的環(huán)狀RNA。RNase R消化法和Sanger測序鑒定環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性及成環(huán)位點(diǎn)。在另一獨(dú)立隊(duì)列80例樣品中分析候選環(huán)狀RNA與卵巢儲(chǔ)備標(biāo)記物和輔助生殖技術(shù)結(jié)局的相關(guān)性，并評估其預(yù)測價(jià)值；最后利用生物信息學(xué)方法預(yù)測這些候選環(huán)狀RNA參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　1. IL-6在小鼠和人卵巢中的表達(dá)

5、隨著增齡而顯著增加，與年齡呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。高濃度的IL-6顯著抑制竇前卵泡的生長和雌孕激素的生成，并降低卵母細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，阻礙卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力的恢復(fù)。高濃度IL-6處理的卵泡中卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，可見受損線粒體的聚集，伴隨ROS生成增加。IL-6對卵泡的負(fù)向調(diào)控可能與它激活促凋亡蛋白、降低抗凋亡蛋白、抑制自噬活性有關(guān)。有趣的是，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與老年對照組小鼠相比，IL-6信號(hào)通路抑制劑托珠單抗能提高老年小鼠卵巢

6、對促性腺激素的反應(yīng)性增加獲卵數(shù)，降低卵母細(xì)胞異常減數(shù)分裂的發(fā)生，改善卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體集聚，提高年老小鼠血清AMH和雌激素水平。托珠單抗對老年小鼠卵巢的保護(hù)作用可能與它抗凋亡和提高自噬活性有關(guān)。
　　2.芯片結(jié)果顯示人顆粒細(xì)胞環(huán)狀RNA表達(dá)譜在女性衰老進(jìn)程中發(fā)生顯著改變，而且通過 qRT-PCR確認(rèn)了 circRNA_103829、circRNA_103827、circRNA_104816和circRNA_101889的表達(dá)差異。在

7、校正促排卵方案的影響后，circRNA_103827和circRNA_104816水平仍與女性年齡顯著正相關(guān)。此外，顆粒細(xì)胞中這兩個(gè)環(huán)狀RNA的表達(dá)水平與血清 AMH、 AFC、獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。ROC曲線分析表明circRNA_103827和circRNA_104816對臨床妊娠結(jié)局具有一定的預(yù)測價(jià)值，其中circRNA_103827用于活產(chǎn)的預(yù)測性能為0.698[0.570-0.825]，靈敏度為77.2％，特異性

8、為60.9％（P=0.006），circRNA_104816的預(yù)測價(jià)值為0.645[0.507-0.783]（P=0.043）。生物信息學(xué)分析顯示這兩個(gè)環(huán)狀RNA可能參與了能量代謝、細(xì)胞周期等生物學(xué)過程，以及類固醇激素生成、細(xì)胞粘附等信號(hào)通路。
　　結(jié)論:
　　1. IL-6在人和小鼠卵巢中的表達(dá)均呈增齡性的升高，升高的IL-6是竇前卵泡發(fā)育的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，能引起卵泡發(fā)育成熟障礙和類固醇激素生成受損。它對卵泡發(fā)育成熟的調(diào)控作

9、用可能與促凋亡、抑制自噬活性以及受損線粒體的集聚有關(guān)。此外， IL-6抑制劑托珠單抗注射能提高老年小鼠卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，改善老年小鼠惡化的卵母細(xì)胞質(zhì)量。因此，隨年齡增長而升高的IL-6可能是導(dǎo)致女性內(nèi)分泌功能異常、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降和卵巢低反應(yīng)性的重要因素，阻斷IL-6信號(hào)通路有望成為新的提高高齡婦女生育結(jié)局和延長卵巢壽命的方法。
　　2.人顆粒細(xì)胞中環(huán)狀 RNA的表達(dá)受年齡的影響，隨年齡增長而顯著上調(diào)的circRNA_10