Alport綜合征和SIOD患者的基因診斷及產(chǎn)前診斷研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 Alport綜合征的分子遺傳學(xué)
　　背景:Alport綜合征(Alport syndrome，AS)是一種臨床上以反復(fù)鏡下或肉眼血尿，慢性腎功能不全為主的進行性遺傳性腎炎，常伴有眼部病變和高頻神經(jīng)性耳聾。Ⅳ膠原α3（COL4A3）、α4(COL4A4)、α5(COL4A5)基因突變是導(dǎo)致Alport綜合征病發(fā)的主要原因。本病的遺傳方式主要分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和X

2、-連鎖顯性遺傳。其中由Ⅳ膠原α5突變導(dǎo)致的X-連鎖顯性遺傳是AS的主要遺傳方式，約占AS的85％。由于AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5分別包含52、48和53個外顯子，且基因變異橫跨這三種膠原基因，故目前尚未發(fā)現(xiàn)存在突變熱點。AS是一種具有臨床異質(zhì)性的基底膜腎病，臨床診斷上有時易與薄基底膜腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等腎臟疾病相混淆，造成誤診或漏診。目前第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展為AS的基因診斷奠定了基礎(chǔ)，使得快速高

3、效的對AS致病基因的定位和突變類型的篩查成為可能。
　　方法:本文收集了6個疑似或確診的AS的家系，利用全外顯子組測序技術(shù)對AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5進行突變篩查，通過PCR擴增和Sanger測序技術(shù)在家系中行突變位點的驗證。對突變位點行序列同源性的比對，觀察位點在進化上的保守性。同時采用生物信息學(xué)的方法對突變是否具有致病性進行分析。對于錯義突變采用SIFT和Polyphen-2進行有害性分析，采用Ma

4、xEntScan觀察剪切突變是否影響RNA的剪切。對200名正常對照行突變位點的測序，來排除突變位點為多態(tài)性位點的可能性。
　　結(jié)果:通過全外顯子組測序共檢測出5個新的突變和2個已知的致病突變，其中包括2個新的c.4348C＞T(p.R1450X)、c.352G＞A(p.G118R)COL4A3突變，2個COL4A5新的突變c.3455-2A＞G、c.3817G＞A(p.G1273S)和2個已知的致病突變c.796C＞T(p.R2

5、66X)、c.2858G＞T(p.G953V)，1個COL4A4的新的突變c.1099G＞A(p.G367S)。這些突變在AS家系中測序發(fā)現(xiàn)與疾病均呈共分離。同源性比對結(jié)果顯示突變位點在進化上也是高度保守的。通過生物信息學(xué)對突變的致病性分析發(fā)現(xiàn)，無論是錯義突變還是剪切突變對AS均是有害突變，一旦突變將影響基因的功能。
　　結(jié)論:本研究共發(fā)現(xiàn)了5個新的AS的致病基因進一步豐富了突變數(shù)據(jù)庫，為疑似的AS從致病基因?qū)用孢M行了確診，避免了

6、誤診或漏診。進一步揭示了基因診斷對臨床的具有重要意義，而致病基因的發(fā)現(xiàn)將為患者提供合理的預(yù)后治療，并為家族成員的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。
　　第二部分 SIOD的分子遺傳學(xué)研究
　　背景:Schimke免疫骨發(fā)育不良(Schimke immunoosseous dysplasia，SIOD)是一種臨床以脊柱骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia，SED)，身材矮小，T細胞缺乏，進行性腎病綜

7、合征和特殊面容為主要特征的罕見的常染色體隱性遺傳病。本病的發(fā)病率約為1∶(100萬～300萬)。而SMARCAL1是目前SIOD唯一已知的致病基因，約有50％的患者無法檢測到其致病突變。SIOD是一種具有臨床異質(zhì)性的累及多個系統(tǒng)的疾病，臨床表現(xiàn)往往從輕度表型到嚴重表型不等。SMARCAL1基因突變中往往無義突變和錯義突變居多，而錯義突變易引起SIOD輕度的臨床表型，而無義突變及與其他類型的組合突變都易造成嚴重的SIOD表型的出現(xiàn)。目前與

8、國外研究相比，國內(nèi)關(guān)于SIOD的研究還知之甚少。
　　方法:本研究收集到一例臨床表型疑似SIOD的患者，利用PCR擴增和Sanger測序技術(shù)對致病基因SMARCAL1基因行突變研究。然后對突變位點行序列同源性的比對，觀察位點在進化上的保守性。同時采用生物信息學(xué)的方法對突變是否具有致病性進行分析。對于錯義突變采用SIFT和Polyphen-2進行有害性分析，采用MaxEntScan觀察剪切突變是否影響RNA的剪切。對200名正常對照

9、行突變位點的測序，來排除突變位點為多態(tài)性位點的可能性。
　　結(jié)果:通過直接測序發(fā)現(xiàn)了2個SMARCAL1基因的突變c.1933C＞T，(p.R645C)和c.2450G＞A (p.R817H)。R645C突變來自臨床表型正常的母親，為已知的致病基因;而R817H為新的突變來源于臨床表型正常的父親。同源性比對結(jié)果顯示這兩個突變位點在進化上也是高度保守的。生物信息學(xué)對突變的致病性分析發(fā)現(xiàn)，R817H的錯義突變SIFT軟件的預(yù)測值為0和

10、Polyphen-2軟件預(yù)測值為1，此兩個的值都說明突變對SMARCAL1基因功能的正常發(fā)揮是有害的。
　　結(jié)論:本研究共發(fā)現(xiàn)了1個新的復(fù)合的SMARCAL1基因突變導(dǎo)致SIOD的發(fā)生，進一步豐富了SMARCAL1基因突變數(shù)據(jù)庫，并對研究中的疑似SIOD患者從致病基因?qū)用孢M行了確診，避免了誤診或漏診。進一步揭示了基因診斷對臨床的具有重要意義，而致病基因的發(fā)現(xiàn)將為患者提供合理的預(yù)后治療，并為家族成員的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

11、r>　　第三部分 Alport綜合征三家系的產(chǎn)前基因診斷
　　背景:Alport綜合征臨床表現(xiàn)最突出的是血尿，但是隨著年齡的增長可出現(xiàn)少量蛋白尿甚至大量蛋白尿，并且最終逐漸進展為腎功能衰竭從而需要進行透析甚至腎臟的移植。然而目前Alport綜合征尚無有效的根治辦法且預(yù)后差，AS的產(chǎn)前診斷可以有效的避免患兒的再次出生以減輕家庭及國家的精神和經(jīng)濟壓力。因此對于孕期的前期診斷尤其是產(chǎn)前基因診斷顯得尤為重要。
　　方法:收集AS三家

12、系先證者及其父母的外周血，并分別采集先證者孕期為18周、20周和20周的母親的羊水10ml。采用STR技術(shù)來排除母體細胞的污染，然后行PCR擴增，再進行DNA測序。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示三家系的母體細胞均無污染，經(jīng)過Sanger測序發(fā)現(xiàn)家系Ⅰ的先證者母親羊水檢測尚未發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶同先證者相同的COL4A5基因c.1909C＞T (p.637Q＞X)的雜合無義突變，可以正常分娩;而家系Ⅱ的先證者母親羊水檢測顯示胎兒攜帶有COL4A5基因