禽波氏桿菌免疫PCR檢測(cè)方法的建立及其亞單位疫苗的研制.pdf

1、禽波氏桿菌（Bordetella avium，B.avium）最早于1967年分離自火雞，該菌引起的禽波氏桿菌病是一種高度接觸傳染性疫病，具有高度上呼吸道接觸傳染性，1周齡內(nèi)的雛禽最易感，主要引起禽類的鼻炎、眼炎等呼吸道癥狀，造成種雞場(chǎng)孵化率降低、死胎率高和弱雛增加。在中國(guó)，朱瑞良教授在1991年首次報(bào)道了雞波氏桿菌病，隨后從病雞眼中分離得到了禽波氏桿菌（朱瑞良，1994）。禽波氏桿菌可垂直傳播，又可水平傳播。禽波氏桿菌感染的同時(shí)，常常

2、繼發(fā)或并發(fā)感染免疫抑制病毒（ALV、REV、CIAV等）、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和熒光假單胞菌，使禽波氏桿菌病的危害不斷放大。近幾年，在全國(guó)不同地區(qū)經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)禽波氏桿菌的感染率在10％到50％之間，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)該病做出及時(shí)快速的診斷及防控十分必要，因此，禽波氏桿菌快速靈敏的診斷方法的建立和疫苗的制備在預(yù)防禽波氏桿菌感染和及時(shí)診斷治療方面顯得尤為重要。本研究由以下五個(gè)部分組成:
　　 1.禽

3、波氏桿菌外膜蛋白單克隆抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)分析
　　 對(duì)本試驗(yàn)室凍存的3株雜交瘤細(xì)胞株(3G10、4A3和4E8)進(jìn)行復(fù)蘇，經(jīng)過(guò)3次有限稀釋法克隆后，制備腹水。通過(guò)間接ELISA試驗(yàn)證明，凍存后復(fù)蘇的3株雜交瘤細(xì)胞株均能穩(wěn)定的分泌抗體，經(jīng)檢測(cè)得出產(chǎn)生的腹水效價(jià)較高，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的單抗效價(jià)為1∶320～1∶640，腹水中單抗效價(jià)為1∶6400～1∶12800。測(cè)定單克隆抗體的飽和工作濃度，繪制單克隆抗體的飽和曲線圖，根據(jù)曲線得

4、出單克隆抗體3G10、4A3、4E8的飽和工作濃度分別為1∶80、1∶80和1∶160。然后用ELISA相加試驗(yàn)分析單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)計(jì)算相加指數(shù)AI來(lái)分析抗原位點(diǎn)的結(jié)合情況，本試驗(yàn)復(fù)蘇的3株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，進(jìn)行相加ELISA試驗(yàn)，3G10、4A3和4E8的相加指數(shù)均小于50％，說(shuō)明3株單克隆抗體識(shí)別的抗原位點(diǎn)可能相同或者比較接近。經(jīng)westem-blot試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，3株單克隆抗體均特異性識(shí)別禽波氏桿菌外膜蛋白

5、58KD上的抗原表位。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)單克隆抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)的分析，為特異性診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.免疫PCR技術(shù)檢測(cè)禽波氏桿菌方法的建立
　　 選擇抗體效價(jià)最高的單克隆抗體4E8株作為包被抗體，包被在酶標(biāo)板上，使用禽波氏桿菌菌體抗原免疫家兔制備多克隆抗體，以多克隆抗體作為檢測(cè)抗體。以pUC19質(zhì)粒為模板，用生物素標(biāo)記的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到生物素標(biāo)記的DNA報(bào)告分子。使用鏈霉親和素作為連接分子，將生物素標(biāo)

6、記的報(bào)告DNA連接到生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG分子上，利用PCR擴(kuò)增報(bào)告DNA分子，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后觀察出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶的情況，如果出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶，那表明待檢樣品中含有禽波氏桿菌。
　　 試驗(yàn)中對(duì)生物素標(biāo)記的報(bào)告DNA和鏈霉親和素的工作濃度進(jìn)行了測(cè)定，得出生物素標(biāo)記的報(bào)告DNA最適工作濃度為10ng/mL，鏈霉親和素最適工作濃度為10ng/mL。對(duì)傳統(tǒng)的間接ELISA方法與建立的免疫PCR的靈敏度進(jìn)行比較，間接ELI

7、SA方法檢測(cè)出禽波氏桿菌菌液的最低濃度為103CFU/mL，免疫PCR法的最低檢測(cè)濃度為1 CFU/mL。因此，本試驗(yàn)建立的免疫PCR方法的靈敏度比間接ELISA方法提高了近103倍。然后利用禽波氏桿菌、大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)氏菌、雞奇異變形桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和綠膿桿菌對(duì)建立的免疫PCR方法進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果說(shuō)明該方法具有高度特異性。
　　 3.免疫PCR檢測(cè)禽波氏桿菌的應(yīng)用研究
　　 對(duì)試驗(yàn)室保存的1991年至今

8、分離到的22株禽波氏桿菌進(jìn)行免疫PCR的檢測(cè)，所有菌株均擴(kuò)增出了特異性條帶，說(shuō)明該方法可以用于對(duì)禽波氏桿菌的檢測(cè)。
　　 在對(duì)患病雞場(chǎng)中采集病料的檢測(cè)中，常規(guī)的細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定，確切的鑒定某種細(xì)菌的感染最少需要3-4d的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。免疫PCR方法能夠特異性的檢測(cè)出禽波氏桿菌的感染，而且僅需要20h左右，節(jié)省了時(shí)間。
　　 對(duì)患病雞場(chǎng)采集的130份血清的檢測(cè)中，使用了平板凝集試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)和免疫PCR試驗(yàn)三

9、種方法，并對(duì)三種試驗(yàn)進(jìn)行比較。平板凝集試驗(yàn)結(jié)果有82份血清樣本為陽(yáng)性，25份可疑，陽(yáng)性率為63.1％;間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果有96份血清樣本為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為73.8％;而免疫PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)其它兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性血清全部顯示陽(yáng)性結(jié)果，從判斷為可疑或是陰性的檢查樣品中也檢測(cè)出了陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為80.7％。三種檢驗(yàn)方法相比，免疫PCR比平板凝集試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)更加敏感、檢出率更高。
　　 在對(duì)禽波氏桿菌感染雛雞后

10、在雞體內(nèi)定植規(guī)律的檢測(cè)中，感染后1d，能夠在氣管和肺臟中經(jīng)PCR擴(kuò)增出特異性條帶，并且一直持續(xù)存在至第6d采樣結(jié)束;感染4d后，在心臟、肝臟和脾臟中擴(kuò)增出特異性條帶;感染后6d，在腎臟中擴(kuò)增出特異性條帶。檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于細(xì)菌涂板培養(yǎng)，檢出時(shí)間提前。
　　 4.禽波氏桿菌分離株抗原性與免疫原性差異分析
　　 首先將復(fù)壯的22株禽波氏桿菌免疫動(dòng)物制備高免血清，利用凝集試驗(yàn)測(cè)定各菌株血清效價(jià)的高低，結(jié)果顯示了各菌株抗原性的大小。根

11、據(jù)凝集試驗(yàn)的結(jié)果，按照血清型和基因型的不同，選擇出8株抗原性較高的禽波氏桿菌來(lái)進(jìn)行交叉凝集試驗(yàn)和免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，分析菌株之間是否存在共同的抗原成分。然后進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，分析各菌株間的交叉免疫保護(hù)情況。
　　 凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，22株分離株的血清抗體效價(jià)在1∶320～1280之間，均能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，抗原性較好。交叉凝集試驗(yàn)和免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示，選擇的8株代表株之間存在共同的抗原成分，但是交叉凝集抗體效價(jià)均比較

12、低。
　　 免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明免疫菌苗對(duì)相應(yīng)菌株的攻擊具有較高的免疫保護(hù)率，對(duì)于同實(shí)驗(yàn)組內(nèi)其它菌株的攻擊，存在交叉免疫保護(hù)，但是保護(hù)率較低。其中Ba15株制備的疫苗對(duì)于同型菌株或者異型菌株的攻擊，均表現(xiàn)出較高的免疫保護(hù)率，Ba11株和Ba8株次之。
　　 5.禽波氏桿菌亞單位疫苗的研制及免疫效果的研究
　　 本試驗(yàn)利用提取的禽波氏桿菌外膜蛋白作為免疫原，選擇松花粉多糖、蜂膠和白油作為免疫佐劑來(lái)進(jìn)行比較。將松花粉

13、多糖設(shè)計(jì)成10mg/mL、20mg/mL和40mg/mL等3個(gè)劑量，把等量的禽波氏桿菌外膜蛋白與不同劑量的松花粉多糖、蜂膠、白油分別組合，制備不同免疫佐劑的禽波氏桿菌亞單位疫苗。將制備的疫苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)，結(jié)果證明，本試驗(yàn)制備的不同免疫佐劑的禽波氏桿菌亞單位疫苗無(wú)菌性和安全性良好。
　　 將制備的疫苗免疫雛雞，檢測(cè)免疫后不同時(shí)間雛雞的體液免疫和細(xì)胞免疫的各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果表明，免疫后，各組疫苗均能刺激機(jī)體產(chǎn)生不同程度的抗體

14、水平，并且能夠持續(xù)存在。而對(duì)于各項(xiàng)細(xì)胞免疫指標(biāo)的測(cè)定說(shuō)明，制備的亞單位疫苗能夠提高免疫動(dòng)物的細(xì)胞免疫水平。在對(duì)各種佐劑的比較中，試驗(yàn)結(jié)果證明Ⅲ組（40mg/ml松花粉多糖）各項(xiàng)指標(biāo)顯著高于其他各組(P＜0.05)，Ⅳ組（蜂膠佐劑）指標(biāo)高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組，但差異不顯著。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示Ⅲ組（含40mg/ml松花粉多糖）保護(hù)率最高，Ⅳ組（蜂膠佐劑）保護(hù)率較好，優(yōu)于Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組。不同佐劑組的免疫指標(biāo)與免疫保護(hù)試驗(yàn)的保護(hù)率呈平行關(guān)系，說(shuō)明40

15、mg/ml松花粉多糖可以作為禽波氏桿菌亞單位疫苗的免疫佐劑，與禽波氏桿菌外膜蛋白混合，用于預(yù)防禽波氏桿菌的感染。
　　 總之，本研究結(jié)果表明試驗(yàn)室保存的三株禽波氏桿菌外膜蛋白的單克隆抗體均特異性識(shí)別禽波氏桿菌外膜蛋白58KD處的抗原位點(diǎn)，位置相同或者相鄰。用4E8株和禽波氏桿菌多克隆抗體建立了雙抗體夾心免疫PCR檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)證明該方法具有較高的靈敏度和特異性，在臨床應(yīng)用上，該方法在檢測(cè)時(shí)間和檢出率方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法，能夠