miR-21-5p拮抗人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：探討miR-21-5p是否具有抗人AT-Ⅱ凋亡作用，并驗(yàn)證直接作用于miR-21-5p的靶基因。
　　方法：1、將人肺泡II型上皮細(xì)胞分為A組（空白對(duì)照組：直接培養(yǎng)）、B組（H2O2損傷組：加入0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)）、C組（miR-21-5p慢病毒過表達(dá)載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)）、D組（慢病毒空白載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)）。分別于0h、12h、24h、36h、48h進(jìn)行CCK8細(xì)胞增殖

2、活力檢測(cè)，了解A、B、C、D四組細(xì)胞增殖活力情況。2、各組于培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，比較A、B、C、D四組細(xì)胞凋亡率。3、Western blot檢測(cè)和Real time PCR檢測(cè)：比較A、B、C、D四組間PDCD4 miRNA的表達(dá)變化，進(jìn)一步明確miR-21-5p與PDCD4的相關(guān)性。4、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：空病毒細(xì)胞組與過表達(dá)miR-21-5p細(xì)胞組在轉(zhuǎn)染48h后，將構(gòu)建好的目的報(bào)告基因PDCD4自然序列（野生型）和

3、PDCD4突變序列（突變型）插入細(xì)胞啟動(dòng)子片段（插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因），使用自動(dòng)發(fā)光檢測(cè)儀讀取熒光強(qiáng)度，比較野生型與突變型的熒光強(qiáng)度，探討miR-21-5p是否直接作用于PDCD4，驗(yàn)證miR-21-5p靶基因是否為PDCD4。
　　結(jié)果：1、CCK8細(xì)胞增殖活力從0h-48h之間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A組的細(xì)胞增殖活力逐漸增強(qiáng)，B、C、D三組的細(xì)胞增殖活力逐漸下降（p＜0.05）,C組細(xì)胞增殖活力下降程度較B、D緩慢

4、（p＜0.05），說明miR-21-5p過表達(dá)后細(xì)胞具有抗凋亡作用。2、流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：與A組比較，B、C、D三組的細(xì)胞凋亡率有所增加，而C組的細(xì)胞凋亡率較B、D兩組低（P＜0.05）。3、Western blot檢測(cè)和Real time PCR檢測(cè)：A組PDCD4 miRNA表達(dá)量＜B、C、D三組（P＜0.05），C組PDCD4 miRNA表達(dá)量＜B、D兩組（P＜0.05），與B組與D組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4、雙熒光素酶報(bào)告基因

5、檢測(cè)：野生型過表達(dá)miR-21-5p細(xì)胞組（構(gòu)建自然序列PDCD4片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因），使熒光相對(duì)強(qiáng)度下降（P＜0.05）；野生型空病毒細(xì)胞組、突變型空病毒細(xì)胞組以及突變型過表達(dá)miR-21-5p細(xì)胞組（PDCD4突變序列插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因），后三組熒光相對(duì)強(qiáng)度無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：1、隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（0h-48h），未予干擾直接培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活力逐漸增強(qiáng)，而經(jīng)過加入0.5mmol/L H

6、2O2培養(yǎng)、miR-21-5p慢病毒過表達(dá)載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)和慢病毒空白載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活力逐漸下降，說明H2O2及慢病毒均加快細(xì)胞損傷，其中miR-21-5p慢病毒過表達(dá)載體+0.5mmol/L H2O2培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活力下降較其他細(xì)胞組緩慢，miR-21-5p具有減輕細(xì)胞凋亡作用。 miR-21-5p過表達(dá)后的細(xì)胞組凋亡率較 H2O2損傷組和空病毒組下降，miR-21-5p具有抗凋