miR-21-5p拮抗肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡的分子機制.pdf

1、目的:觀察miR-21-5p對過氧化氫(H2O2)誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞(TypeⅡalveolar epithelial cell,AEC-Ⅱ)凋亡的影響,探索其抗凋亡的分子機制。
　　方法:AEC-Ⅱ傳代培養(yǎng)分為正常對照組,H2O2損傷組(0.5mmol/L H2O2損傷后繼續(xù)培養(yǎng)),miR-21-5p腺病毒過表達組(miR-21-5p腺病毒載體轉(zhuǎn)染AEC-Ⅱ,轉(zhuǎn)染成功后,0.5mmol/L H2O2誘導凋亡模型),miR-2

2、1-5p陰性轉(zhuǎn)染組(不含miR-21-5p的腺病毒轉(zhuǎn)染 AEC-Ⅱ,轉(zhuǎn)染成功后,0.5mmol/L H2O2誘導凋亡模型);透射電子顯微鏡(transmitting electron microscopy,TEM)檢測細胞凋亡形態(tài);于轉(zhuǎn)染48h用Taq Man實時熒光定量 RT—PCR檢測各組 AEC-Ⅱ的 miR-21-5p表達水平;流式細胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)于轉(zhuǎn)染6h、12h、24h、48h檢測各組細胞早期凋

3、亡率;Western blot檢測每組Bcl-2,Bax,caspase-3三種蛋白的表達水平。
　　結(jié)果:(1) AEC-Ⅱ鑒定:電鏡下可見AEC-Ⅱ的特征性結(jié)構(gòu)——微絨毛及嗜鋨性板層小體。(2)細胞凋亡形態(tài)檢測:電鏡下可見胞質(zhì)回縮,染色質(zhì)凝聚、邊聚,細胞表面微絨毛稀少,嗜鋨性板層小體排空。(3) Taq Man實時熒光定量 RT—PCR檢測各組AEC-Ⅱ的miR-21-5p水平:miR-21-5p過表達組與其他三組相比miR-

4、21-5p的水平明顯增高(p<0.05),(4)細胞早期凋亡率檢測:與正常對照組比較,H2O2損傷組、miR-21-5p過表達組及 miR-21-5p對照組的細胞凋亡率均隨損傷時間的延長逐漸上升;與 H2O2損傷組比較,同一時間點 miR-21-5p過表達組的細胞凋亡率明顯低于 H2O2損傷組(p<0.05),miR-21-5p陰性對照組與H2O2損傷組比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。(5) Western blot檢測各組AEC

5、-ⅡBcl-2,Bax和caspase-3的表達:miR-21-5p過表達組Bax,caspase-3蛋白表達水平明顯低于H2O2損傷組(p<0.05),Bcl-2蛋白表達水平明顯高于H2O2損傷組(p<0.05)。
　　結(jié)論:(1) miR-21-5p具有抗 AEC-Ⅱ凋亡作用。(2)以miR-21-5p作為AEC-Ⅱ凋亡調(diào)控的新靶點具有潛在應(yīng)用價值。(3)腺病毒載體是轉(zhuǎn)染AEC-Ⅱ的一種比較成功的基因轉(zhuǎn)導載體。(4) miR-