ESAT-6、CFP-10及rCFP10-ESAT6在艾滋病合并結(jié)核桿菌感染診斷價(jià)值中的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建結(jié)核重組抗原ESAT-6、CFP-10及融合抗原rCFP10-ESAT6原核表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并在大腸埃希菌進(jìn)行原核表達(dá)。獲得純化的蛋白產(chǎn)物,通過檢測三者作為抗原刺激物在HIV感染者中的特異性T細(xì)胞反應(yīng),為建立艾滋病合并結(jié)核感染的診斷方法提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:應(yīng)用融合PCR(Fusion PCR)技術(shù),從結(jié)核分枝桿菌基因組(HB37v)中成功克隆獲得ESAT-6、CFP-10基因及rCFP10-ESA

2、T6融合基因,連接到pGEM-T載體,測序正確后插入至原核表達(dá)載體pET-32a(+)和pET-28a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),親和層析法純化重組蛋白及融合蛋白；通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、Western blotting免疫印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)證實(shí)表達(dá)蛋白抗原特異性；并將三種純化好的表達(dá)蛋白作為抗原,以健康者、確診的活動性結(jié)核患者分別作為陰性對照、

3、陽性對照,采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immuno-spot,Elispot)檢測HIV感染者中特異性T細(xì)胞反應(yīng),通過患者外周血干擾素-γ分泌量的測定,判斷其是否合并結(jié)核桿菌感染。 結(jié)論:利用大腸埃希菌BL21(DE3)成功表達(dá)、純化了具有良好抗原性的ESAT-6、CFP-10重組蛋白和rCFP10-ESAT6融合蛋白,并以三種蛋白分別作為抗原刺激物,利用Elispot方法對HIV合并結(jié)核感染進(jìn)行檢測,為早