多器官功能障礙綜合征大鼠小腸神經(jīng)-cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌網(wǎng)絡(luò)損傷和大承氣湯防治作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:多器官功能障礙綜合癥（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）是機(jī)體在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克及大手術(shù)等原發(fā)病基礎(chǔ)上，同時(shí)或序貫發(fā)生的兩個(gè)或兩個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙的臨床綜合征。是腹部外科患者死亡的重要原因。近年來研究觀點(diǎn)認(rèn)為，胃腸道是促發(fā)MODS的始動(dòng)器官和靶部位。胃腸功能狀態(tài)被認(rèn)為是判斷危重病人預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有助于有效地阻斷MODS的進(jìn)一步發(fā)展。胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞

2、(interstitialcellsofCajal,ICC)是胃腸慢波的起搏細(xì)胞，并且相互間形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)廣泛分布于消化道。ICC被認(rèn)為是胃腸神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervesystem，ENS)信號(hào)向平滑肌細(xì)胞(smoothmusclecells，SMC)傳送的橋梁和中介。胃腸平滑肌細(xì)胞是胃腸電生理活動(dòng)的最終執(zhí)行者。因此，目前研究觀點(diǎn)認(rèn)為，ENS運(yùn)動(dòng)末梢、ICC和SMC三者相互連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，組成胃腸動(dòng)力基本功能單位(basicf

3、unctionalunitofgastrointestinalmotility，BFUGM)，與胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病密切相關(guān)。
　　 目的:以細(xì)菌性腹膜炎致MODS大鼠模型為研究對(duì)象，觀察大鼠小腸ENS、ICC和平滑肌細(xì)胞SMC的形態(tài)學(xué)變化和凋亡現(xiàn)象，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路和凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及大承氣湯防治后的變化。探討MODS致胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生機(jī)制和大承氣湯的防治機(jī)理，為MODS致胃腸動(dòng)力障礙的臨床預(yù)防和治療提供

4、新的思路。
　　 方法:選擇健康成年Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重200g-250g，隨機(jī)分為對(duì)照組（20只）、MODS組（40只）和大承氣湯治療組（40只）。對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水;MODS組和大承氣湯組大鼠采用無菌條件下腹腔注射E.coloi.懸濁液的方法建立細(xì)菌性腹膜炎致MODS模型。大承氣湯治療組于造模前2日予大承氣湯灌胃，2次/日，每次1ml/100g。造模24小時(shí)后取存活大鼠，麻醉后頸椎脫臼法處死，剖開

5、腹腔取上段小腸用于實(shí)驗(yàn)。分別采用透射電鏡掃描、TUNEL法、免疫組化、免疫熒光和激光掃描共聚焦顯微鏡重建圖像等方法觀察大鼠小腸ENS、ICC和SMC的形態(tài)學(xué)變化和凋亡現(xiàn)象，檢測(cè)信號(hào)通路、凋亡途徑和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，及大承氣湯防治后的變化。
　　 結(jié)果:①小腸組織形態(tài)學(xué)和肌層細(xì)胞因子表達(dá)觀察:與對(duì)照組比較，MODS組大鼠小腸絨毛頂端破裂，粘膜層和肌層結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血;小腸肌層CGRP、HSP70和TG

6、F-β1表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸輕度損傷，絨毛結(jié)構(gòu)完整，粘膜層和肌層充血明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，SMC分布均勻;小腸肌層CGRP、HSP70和TGF-β1表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。
　　 ②小腸腸神經(jīng)系統(tǒng)觀察:與對(duì)照組比較，MODS組大鼠小腸神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，凋亡數(shù)量明顯增加，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC蛋白表達(dá)明顯增加，信號(hào)傳導(dǎo)通路AC

7、h/SP/VIP/NO和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)明顯減少，NGF蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，凋亡數(shù)量明顯減少，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC表達(dá)明顯減少，信號(hào)傳導(dǎo)通路ACh/SP/VIP/NO和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)明顯增加，NGF蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　 ③小腸ICC觀察:與

8、對(duì)照組比較，MODS組大鼠小腸ICC超微結(jié)構(gòu)受到明顯破壞，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集在核中央和周邊，線粒體腫脹，縫隙連接減少;ICC凋亡數(shù)量、線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC表達(dá)明顯增加，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸ICC超微結(jié)構(gòu)損傷輕微，少見細(xì)胞核染色質(zhì)的聚集，個(gè)別線粒體腫脹，縫隙連接增加;ICC凋亡數(shù)量、線粒體凋亡途徑Bax/Bcl

9、-2和蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC表達(dá)明顯減少，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。
　　 ④小腸平滑肌觀察:與對(duì)照組比較，MODS組大鼠小腸平滑肌結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞數(shù)量和肌動(dòng)蛋白表達(dá)明顯減少，細(xì)胞凋亡數(shù)量和凋亡指數(shù)明顯增加，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2/CytC/caspase-9/caspase-3、死亡受體凋亡途徑Fas/Fasl、蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC和凋亡相關(guān)蛋白COX-2/N

10、F-κB/P53表達(dá)明顯增加，信號(hào)傳導(dǎo)通路ACh/NO/SP/VIP、縫隙連接蛋白CX45和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)明顯減少，Ca2+通道蛋白IP3R和RyR表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸平滑肌結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞數(shù)量和肌動(dòng)蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量和凋亡指數(shù)明顯減少，線粒體凋亡途徑Bax/Bcl-2/CytC/caspase-9/caspase-3、死亡受體凋亡途徑Fas/Fas

11、l、蛋白激酶凋亡途徑PKA/PKC和凋亡相關(guān)蛋白COX-2/NF-κB/P53表達(dá)明顯減少，信號(hào)傳導(dǎo)通路ACh/NO/SP/VIP、縫隙連接蛋白CX45和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)明顯增加，Ca2+通道蛋白IP3R和RyR表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　 ⑤小腸腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-平滑肌細(xì)胞(ENS-ICC-SMC)網(wǎng)絡(luò)觀察:與對(duì)照組比較，MODS組大鼠小腸ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)明顯破壞，ICC

12、與腸神經(jīng)的連接減少，與SMC間的縫隙連接減少，間距增大，腸神經(jīng)、ICC和SMC的數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。與MODS組比較，大承氣湯治療組大鼠小腸ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)，ICC與腸神經(jīng)的連接緊密，與SMC間的縫隙連接增加，間距減少，腸神經(jīng)、ICC和SMC數(shù)量明顯增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:①M(fèi)ODS大鼠胃腸道明顯擴(kuò)張，致死率極高，小腸肌層中CGRP、TGF-β1蛋白表達(dá)的增加可能導(dǎo)致小腸肌層組織

13、炎癥反應(yīng)和應(yīng)激損傷的加劇，同時(shí)上調(diào)HSP70蛋白的表達(dá)發(fā)揮自我保護(hù)作用。而大承氣湯可以明顯地降低MODS大鼠的死亡率，促進(jìn)胃腸動(dòng)力的恢復(fù)。大承氣湯可以通過下調(diào)大鼠小腸肌層組織中的CGRP、TGF-β1蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和應(yīng)激損傷的加劇，從而下調(diào)HSP70蛋白的表達(dá)，保護(hù)小腸平滑肌的收縮功能。
　　 ②MODS大鼠小腸神經(jīng)可能通過線粒體和蛋白激酶凋亡途徑的激活、細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路的損傷以及NGF表達(dá)的下降使得小腸神經(jīng)凋亡數(shù)

14、量明顯增加，形態(tài)結(jié)構(gòu)受到明顯破壞。而大承氣湯可以明顯地抑制線粒體和蛋白激酶凋亡途徑的激活、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路和NGF的表達(dá)，從而明顯減輕小腸神經(jīng)的凋亡和損傷，修復(fù)小腸神經(jīng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)胃腸動(dòng)力的恢復(fù)。
　　 ③MODS大鼠小腸ICC凋亡數(shù)量增加，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)受到明顯破壞，其機(jī)制可能與超微結(jié)構(gòu)的損傷、線粒體和蛋白激酶凋亡途徑的激活和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)載體蛋白caveolin-1表達(dá)的減少有關(guān)。而大承氣湯可以通過明顯地保護(hù)ICC的超微

15、結(jié)構(gòu)、抑制線粒體和蛋白激酶途徑的激活和保護(hù)信號(hào)載體蛋白caveolin-1的表達(dá)，從而抑制ICC的凋亡，修復(fù)ICC網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，恢復(fù)胃腸動(dòng)力。
　　 ④MODS大鼠小腸SMC凋亡數(shù)量明顯增加，形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，其機(jī)制可能是平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ca2+通道蛋白IP3R和RyR表達(dá)的減少，線粒體、死亡受體、蛋白激酶凋亡途徑的激活，凋亡相關(guān)蛋白COX-2/NF-κB/P53表達(dá)的增加，以及細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路的損傷。而大承氣湯可以通過明顯地

16、保護(hù)平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ca2+通道蛋白IP3R和RyR的表達(dá)，抑制線粒體、死亡受體、蛋白激酶凋亡途徑的激活，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白COX-2/NF-κB/P53的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路等機(jī)制，減少小腸SMC的凋亡數(shù)量，保護(hù)平滑肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)胃腸動(dòng)力的恢復(fù)。
　　 ⑤MODS大鼠小腸ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到明顯破壞，其機(jī)制可能與超微結(jié)構(gòu)的損傷，小腸神經(jīng)、ICC和SMC數(shù)量的明顯減少密切相關(guān)。而大承氣湯可以明顯地保護(hù)E