基于在線敲出技術和RTCA分析的龍眼核多酚關鍵抗氧化功能因子的快速篩選與活性評價.pdf

1、龍眼核中含有大量的活性多酚化合物，在龍眼加工過程中，約占龍眼果鮮重17％的龍眼核被廢棄，造成嚴重的資源浪費。因此，高效利用龍眼核中的多酚類物質是促進龍眼高值化綜合利用的有效途徑。但是目前龍眼核多酚中具有強抗氧化作用的關鍵成分尚不明確，本課題以此為切入點，通過功能組分的在線敲出技術，結合體外化學評價方法，快速篩選出龍眼核中的抗氧化關鍵成分。采用高效液相色譜-電噴霧-質譜(HPLC-ESI-MS)、傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR-

2、MS）和核磁共振(NMR)等方法對篩選出的抗氧化功能組分中的酚類化合物進行了結構鑒定，并在不同的體外化學和細胞模型中進一步確證了在線篩選方法的可行性。利用微量量熱法和實時細胞阻抗分析法比較了龍眼核抗氧化關鍵成分和12種代表性酚類化合物對H2O2誘導的小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3氧化損傷的保護作用，首次建立了基于細胞微電子阻抗技術的抗氧化活性成分快速篩選方法。主要研究結果如下:
　　1.龍眼核多酚的提取及純化
　　采用正交

3、設計試驗優(yōu)化龍眼核多酚的提取條件。在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度為自變量，以龍眼核多酚得率為考察指標，經過四因素三水平正交試驗得出龍眼核多酚提取的最佳工藝條件:乙醇體積分數40％、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度70℃、提取時間90min。通過對4種大孔樹脂靜態(tài)吸附及動態(tài)解吸性能的比較，確定D3520型樹脂為龍眼核多酚分離純化的理想樹脂，洗脫劑乙醇體積分數為40％時，樹脂對多酚的解吸率最高。

4、　　2.龍眼核抗氧化關鍵成分的在線篩選
　　采用HPLC在線敲出技術，結合FT-ICR-MS和測定還原能力、清除DPPH自由基能力以及氧自由基吸收能力(ORAC)等體外化學評價方法，篩選出龍眼核中對總抗氧化能力貢獻最大的功能組分2-2及抗氧化功能因子峰4和峰6，而龍眼核多酚的主要成分沒食子酸、以及抗氧化功能組分2-2中的(S)-flavogallonic acid、柯里拉京和沒食子酸乙酯對龍眼核總抗氧化活性的貢獻率則較低。利用HP

5、LC-ESI-MS對抗氧化功能因子峰4和峰6進行了初步結構分析，結果表明，抗氧化功能因子峰4的結構是未知的，峰6可能為鞣花酸的衍生物。
　　3.龍眼核抗氧化關鍵成分的結構鑒定及活性確證
　　采用1H-NMR、13C-NMR、二維異核碳氫相關譜（HMBC）等結構分析手段對在線篩選出的龍眼核抗氧化功能組分的未知結構進行了解析，首次從龍眼核中鑒定出三種酚類化合物，分別是9-O-(3-羧甲基-4-對甲酰苯乙烯基)羥丁酸（化合物2），

6、2-羥基-3-甲氧基咖啡酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（化合物4），3'-O-甲基-4'-O-(4-O-沒食子?；?α-L-吡喃鼠李糖基)鞣花酸（化合物6）。采用水相體系和脂相體系（總抗氧化能力、ORAC、抑制β-胡蘿卜素褪色、抑制黃嘌呤氧化酶活性）證實了新鑒定的化合物4和6的抗氧化能力最強，對總酚抗氧化活性的貢獻最大。選用NIH-3T3細胞模型進一步確證龍眼核關鍵成分在細胞生理水平的抗氧化活性，結果表明，相較于在體外化學體系中活性較

7、弱的3'-O-甲基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P7)和沒食子酸乙酯(P8)，抗氧化功能因子2-羥基-3-甲氧基咖啡酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P4)，3'-O-甲基-4'-O（4-O-沒食子?；?α-L-吡喃鼠李糖基）鞣花酸(P6)在細胞體系中表現出更強的抗氧化作用，可以有效提高NIH-3T3細胞抗氧化防御酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低H2O2誘導的過量活性氧(ROS)水平，緩解線粒體和DNA損傷，抑制細胞

8、凋亡，保護細胞免于受到氧化應激的影響。龍眼核抗氧化功能因子在細胞體系的活性與基于體外化學評價的活性相關良好，充分證明了前期在線篩選方法的可行性。
　　4.微量量熱法用于多酚類抗氧化活性篩選的初探
　　為找尋能在細胞生理水平快速、高效篩選抗氧化功效成分的方法，采用微量量熱法探討了四種龍眼核多酚，2-羥基-3-甲氧基咖啡酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P4)，3'-O-甲基-4'-O-（4-O-沒食子?；?α-L-吡喃鼠李糖基

9、）鞣花酸(P6)，3'-O-甲基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(P7)和沒食子酸乙酯(P8)，對H2O2誘導的NIH-3T3細胞氧化損傷的影響。實驗從熱化學角度證實了龍眼核抗氧化功能因子P4和P6對細胞損傷具有更好的抗氧化修復作用。但是通過關聯(lián)生物熱檢測和傳統(tǒng)細胞檢測的結果，發(fā)現二者的相關性并不高，推測生物熱動力學體系可能并不能準確客觀地反映酚類化合物的抗氧化功效。采用12種具有代表性的已知酚類化合物驗證生物熱模型的可行性，結果

10、表明，由生物熱動力學方法得到的化合物的抗氧化活性與前期基于體外化學實驗得到的結果存在差異，提示因酚類加入而引起的細胞代謝產熱的變化并不能準確反映酚類化合物的抗氧化活性，因此生物熱模型并不適用于抗氧化活性成分的快速篩選及評價。
　　5.建立基于細胞微電子阻抗技術的抗氧化活性成分的快速篩選方法
　　采用基于微電子阻抗技術的實時細胞分析(RTCA)探討了四種龍眼核多酚(P4、P6、P7、P8)對H2O2誘導的NIH-3T3細胞氧化

11、損傷的保護作用。實驗從電化學角度證實了龍眼核抗氧化功能因子P4和P6對細胞損傷具有更好的抗氧化修復效果。通過關聯(lián)RTCA和傳統(tǒng)細胞檢測的結果，發(fā)現二者高度相關，推測基于細胞響應的微電子阻抗變化可以準確反映酚類化合物對NIH-3T3細胞損傷的抗氧化修復作用。采用12種具有代表性的已知多酚類化合物驗證RTCA模型的可行性和適用性，結果表明，由RTCA體系得到的化合物的抗氧化活性與前期基于體外化學實驗得到的結果完全一致，說明RTCA體系的電子