病毒顆粒介導(dǎo)的寡核苷酸靶向給藥技術(shù)研究.pdf

1、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASONs)作為新型的基因治療藥物受到國內(nèi)外科研人員及各大制藥公司的普遍關(guān)注。但此類藥物生物學(xué)穩(wěn)定性較差,易被體內(nèi)核酸酶降解;另外由于ASONs分子為多聚陰離子大分子,生理條件下很難通過帶負電荷的細胞膜,因此生物利用度低、靶組織內(nèi)聚集濃度低。目前,可通過對天然核酸序列經(jīng)過各類化學(xué)修飾(如:硫代修飾、混合骨架核酸)或構(gòu)建新的核酸類似物(如:肽核酸)等來增加ASONs的穩(wěn)定

2、性;而如何提高ASONs的胞內(nèi)攝取和靶向遞送仍是目前反義藥物開發(fā)急需解決的問題。近年來研究人員對多種藥物遞送方式進行了研究,包括使用脂質(zhì)體類遞送載體、陽離子多聚物類載體、多肽蛋白類載體以及一些特異性受體的配體。其中,多肽蛋白類修飾是目前ASONs靶向遞送研究的熱點。靶向肽具有分子量小、組織穿透能力更強、低免疫原性和高親和力、容易大量合成等優(yōu)點,在藥物靶向?qū)胂到y(tǒng)(drug delivery system,DDS)中具有廣闊的應(yīng)用前景。<

3、br>　　在前期工作中,本室篩選獲得多條抗流感病毒(IV)效果較好的反義核酸序列(Prop5,專利申請?zhí)?201010179175.5,公開號:CN101864421A;Flutide,專利號ZL97120355.5)。同時還針對幾種重要的乙肝病毒(HBV)感染關(guān)鍵分子,如ASGPR、fibronectin、EREG、ABHD2,篩選得到4條特異性好的ASONs(專利分別為ZL2004100583001.1、ZL200410073618

4、.7、ZL200610075976.0和ZL200610075977.5),在體內(nèi)外均具有較強的抗HBV活性。越來越多的研究證明了ASONs是病毒感染性疾病的有效治療手段之一。由于病毒是一類嚴格的細胞內(nèi)寄生病原體,病毒基因組只有進入到宿主細胞內(nèi)才能進行子代病毒的復(fù)制和進一步的感染,而ASONs要發(fā)揮反義抑制作用必須要進入靶細胞,因此能否尋找到一條途徑將抗病毒ASONs直接導(dǎo)入到病毒感染的細胞內(nèi)至關(guān)重要。目前ASONs的靶向轉(zhuǎn)運研究中多選

5、取各類細胞表面特異性受體的配體作為靶向分子,而針對病毒表面特異性抗原或蛋白的特異結(jié)合配體作為ASONs靶向轉(zhuǎn)運的靶向分子尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。本室提出一種基于病毒顆粒介導(dǎo)的ASONs靶向轉(zhuǎn)運策略,期望借助病毒顆粒感染入胞過程將ASONs直接導(dǎo)入病毒感染細胞內(nèi),解決ASONs胞內(nèi)攝取有限和靶向性差的問題,最終起到增強抗病毒活性、降低給藥量和毒副作用的目的。
　　本研究主要以抗流感病毒的ASONs(Prop5)為被修飾對象。首先采用原核表

6、達和噬菌體展示技術(shù)進行流感病毒表面蛋白HA和NA特異性結(jié)合多肽的篩選,各得到一條特異性結(jié)合肽H17和N3,通過熒光顯微鏡及流式細胞儀等對這兩條結(jié)合肽在病毒感染細胞內(nèi)的攝取與分布進行考察,發(fā)現(xiàn)流感病毒感染可顯著增加多肽H17在病毒感染細胞中的攝取,隨著感染時間的延長攝取率逐漸增多。在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)H17可與病毒共同分布于細胞質(zhì)中。雖然多肽N3在病毒感染細胞中的攝取率也有所提升,但增加速度較慢。另外,對H17的抗病毒活性檢測發(fā)現(xiàn)

7、其對流感病毒所致細胞病變沒有顯著地抑制作用,且在給藥100μM不會對細胞增殖產(chǎn)生影響。因此,H17將作為ASONs遞送系統(tǒng)中的靶向分子用于后續(xù)遞送系統(tǒng)的合成與構(gòu)建。隨后我們通過兩種不同的合成路線對多肽及ASONs進行共價偶聯(lián)。最終合成并制備出包括熒光標(biāo)記物在內(nèi)的4種多肽-ASONs綴合物,通過RP-HPLC分析及MALDI-TOF-MS鑒定綴合物結(jié)構(gòu)及分子量正確。通過對綴合物的理化性質(zhì)考察發(fā)現(xiàn)多肽偶聯(lián)不影響ASONs與互補鏈的結(jié)合,也不

8、影響ASONs的血清穩(wěn)定性。最后我們初步確定了綴合物的保存條件。接下來通過激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術(shù)及活體成像技術(shù)對綴合物進行胞內(nèi)攝取、分布及組織內(nèi)分布的考察,發(fā)現(xiàn)流感病毒結(jié)合肽的修飾對ASONs入胞過程具有選擇特異性,病毒靶向肽修飾可顯著提高病毒感染細胞對ASONs的攝取,且修飾化合物(prop5-HABP)的透膜率具有顯著的時間依賴性和濃度依賴性。病毒靶向肽修飾還可使ASONs在病毒感染組織內(nèi)快速蓄積。采用Western blot

9、及熒光定量PCR法考察了不同濃度下prop5修飾前后對細胞內(nèi)靶基因的抑制作用及對流感病毒復(fù)制的抑制作用,檢測結(jié)果均顯示多肽修飾后可顯著提高prop5對靶基因PDCD5的抑制作用和抗IV活性,且不影響細胞的增殖。上述結(jié)果證明病毒靶向肽修飾可實現(xiàn)對ASONs的定向轉(zhuǎn)運。
　　為進一步驗證病毒靶向遞送系統(tǒng)的可行性,我們選擇前期篩選得到的具有抗HBV活性的靶向Fibronetin的FN1(序列:5’-GCTCATCTCCCTCCTCACT

10、C-3’)為靶向修飾研究的目標(biāo)ASON。根據(jù)文獻(JMicrobiol,2007,45:528-533)報道,確定HBV前S1抗原特異性結(jié)合肽B3作為靶向到HBV顆粒的分子,二者偶聯(lián)后得到多肽-ASONs綴合物FN1-B3。通過對其Tm值進行測定,發(fā)現(xiàn)多肽綴合不會影響FN1與互補鏈的結(jié)合。之后采用HepG2.2.15細胞和HBV陽性血清感染人原代肝細胞模型對多肽修飾后FN1的靶向性、透膜性及抗病毒活性進行考察,結(jié)果表明HBV結(jié)合肽偶聯(lián)到

11、FN1上同樣可提高其在HBV感染細胞中的攝取及抗病毒活性。
　　綜上所述,通過在兩種不同病毒感染細胞模型上的驗證實驗,均證明所提出的通過病毒顆粒介導(dǎo)的寡核苷酸靶向轉(zhuǎn)運策略是可行的,病毒特異性結(jié)合肽與抗病毒ASONs偶聯(lián)后,可在病毒感染入胞過程中,通過其特異性地結(jié)合病毒顆粒將ASONs帶入被感染細胞及組織內(nèi),實現(xiàn)對ASONs的定向轉(zhuǎn)運,發(fā)揮抗病毒療效。本課題提出的基于病毒靶向肽修飾的ASONs靶向轉(zhuǎn)運與以往的靶向遞送系統(tǒng)作用機制完全