病毒顆粒介導(dǎo)的寡核苷酸靶向給藥技術(shù)研究.pdf

1、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASONs)作為新型的基因治療藥物受到國(guó)內(nèi)外科研人員及各大制藥公司的普遍關(guān)注。但此類(lèi)藥物生物學(xué)穩(wěn)定性較差,易被體內(nèi)核酸酶降解;另外由于ASONs分子為多聚陰離子大分子,生理?xiàng)l件下很難通過(guò)帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜,因此生物利用度低、靶組織內(nèi)聚集濃度低。目前,可通過(guò)對(duì)天然核酸序列經(jīng)過(guò)各類(lèi)化學(xué)修飾(如:硫代修飾、混合骨架核酸)或構(gòu)建新的核酸類(lèi)似物(如:肽核酸)等來(lái)增加ASONs的穩(wěn)定

2、性;而如何提高ASONs的胞內(nèi)攝取和靶向遞送仍是目前反義藥物開(kāi)發(fā)急需解決的問(wèn)題。近年來(lái)研究人員對(duì)多種藥物遞送方式進(jìn)行了研究,包括使用脂質(zhì)體類(lèi)遞送載體、陽(yáng)離子多聚物類(lèi)載體、多肽蛋白類(lèi)載體以及一些特異性受體的配體。其中,多肽蛋白類(lèi)修飾是目前ASONs靶向遞送研究的熱點(diǎn)。靶向肽具有分子量小、組織穿透能力更強(qiáng)、低免疫原性和高親和力、容易大量合成等優(yōu)點(diǎn),在藥物靶向?qū)胂到y(tǒng)(drug delivery system,DDS)中具有廣闊的應(yīng)用前景。<

3、br>　　在前期工作中,本室篩選獲得多條抗流感病毒(IV)效果較好的反義核酸序列(Prop5,專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?201010179175.5,公開(kāi)號(hào):CN101864421A;Flutide,專(zhuān)利號(hào)ZL97120355.5)。同時(shí)還針對(duì)幾種重要的乙肝病毒(HBV)感染關(guān)鍵分子,如ASGPR、fibronectin、EREG、ABHD2,篩選得到4條特異性好的ASONs(專(zhuān)利分別為ZL2004100583001.1、ZL200410073618

4、.7、ZL200610075976.0和ZL200610075977.5),在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的抗HBV活性。越來(lái)越多的研究證明了ASONs是病毒感染性疾病的有效治療手段之一。由于病毒是一類(lèi)嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生病原體,病毒基因組只有進(jìn)入到宿主細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行子代病毒的復(fù)制和進(jìn)一步的感染,而ASONs要發(fā)揮反義抑制作用必須要進(jìn)入靶細(xì)胞,因此能否尋找到一條途徑將抗病毒ASONs直接導(dǎo)入到病毒感染的細(xì)胞內(nèi)至關(guān)重要。目前ASONs的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)研究中多選

5、取各類(lèi)細(xì)胞表面特異性受體的配體作為靶向分子,而針對(duì)病毒表面特異性抗原或蛋白的特異結(jié)合配體作為ASONs靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的靶向分子尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。本室提出一種基于病毒顆粒介導(dǎo)的ASONs靶向轉(zhuǎn)運(yùn)策略,期望借助病毒顆粒感染入胞過(guò)程將ASONs直接導(dǎo)入病毒感染細(xì)胞內(nèi),解決ASONs胞內(nèi)攝取有限和靶向性差的問(wèn)題,最終起到增強(qiáng)抗病毒活性、降低給藥量和毒副作用的目的。
　　本研究主要以抗流感病毒的ASONs(Prop5)為被修飾對(duì)象。首先采用原核表

6、達(dá)和噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行流感病毒表面蛋白HA和NA特異性結(jié)合多肽的篩選,各得到一條特異性結(jié)合肽H17和N3,通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀等對(duì)這兩條結(jié)合肽在病毒感染細(xì)胞內(nèi)的攝取與分布進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)流感病毒感染可顯著增加多肽H17在病毒感染細(xì)胞中的攝取,隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)攝取率逐漸增多。在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)H17可與病毒共同分布于細(xì)胞質(zhì)中。雖然多肽N3在病毒感染細(xì)胞中的攝取率也有所提升,但增加速度較慢。另外,對(duì)H17的抗病毒活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

7、其對(duì)流感病毒所致細(xì)胞病變沒(méi)有顯著地抑制作用,且在給藥100μM不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。因此,H17將作為ASONs遞送系統(tǒng)中的靶向分子用于后續(xù)遞送系統(tǒng)的合成與構(gòu)建。隨后我們通過(guò)兩種不同的合成路線(xiàn)對(duì)多肽及ASONs進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。最終合成并制備出包括熒光標(biāo)記物在內(nèi)的4種多肽-ASONs綴合物,通過(guò)RP-HPLC分析及MALDI-TOF-MS鑒定綴合物結(jié)構(gòu)及分子量正確。通過(guò)對(duì)綴合物的理化性質(zhì)考察發(fā)現(xiàn)多肽偶聯(lián)不影響ASONs與互補(bǔ)鏈的結(jié)合,也不

8、影響ASONs的血清穩(wěn)定性。最后我們初步確定了綴合物的保存條件。接下來(lái)通過(guò)激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)及活體成像技術(shù)對(duì)綴合物進(jìn)行胞內(nèi)攝取、分布及組織內(nèi)分布的考察,發(fā)現(xiàn)流感病毒結(jié)合肽的修飾對(duì)ASONs入胞過(guò)程具有選擇特異性,病毒靶向肽修飾可顯著提高病毒感染細(xì)胞對(duì)ASONs的攝取,且修飾化合物(prop5-HABP)的透膜率具有顯著的時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性。病毒靶向肽修飾還可使ASONs在病毒感染組織內(nèi)快速蓄積。采用Western blot

9、及熒光定量PCR法考察了不同濃度下prop5修飾前后對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶基因的抑制作用及對(duì)流感病毒復(fù)制的抑制作用,檢測(cè)結(jié)果均顯示多肽修飾后可顯著提高prop5對(duì)靶基因PDCD5的抑制作用和抗IV活性,且不影響細(xì)胞的增殖。上述結(jié)果證明病毒靶向肽修飾可實(shí)現(xiàn)對(duì)ASONs的定向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證病毒靶向遞送系統(tǒng)的可行性,我們選擇前期篩選得到的具有抗HBV活性的靶向Fibronetin的FN1(序列:5’-GCTCATCTCCCTCCTCACT

10、C-3’)為靶向修飾研究的目標(biāo)ASON。根據(jù)文獻(xiàn)(JMicrobiol,2007,45:528-533)報(bào)道,確定HBV前S1抗原特異性結(jié)合肽B3作為靶向到HBV顆粒的分子,二者偶聯(lián)后得到多肽-ASONs綴合物FN1-B3。通過(guò)對(duì)其Tm值進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)多肽綴合不會(huì)影響FN1與互補(bǔ)鏈的結(jié)合。之后采用HepG2.2.15細(xì)胞和HBV陽(yáng)性血清感染人原代肝細(xì)胞模型對(duì)多肽修飾后FN1的靶向性、透膜性及抗病毒活性進(jìn)行考察,結(jié)果表明HBV結(jié)合肽偶聯(lián)到

11、FN1上同樣可提高其在HBV感染細(xì)胞中的攝取及抗病毒活性。
　　綜上所述,通過(guò)在兩種不同病毒感染細(xì)胞模型上的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),均證明所提出的通過(guò)病毒顆粒介導(dǎo)的寡核苷酸靶向轉(zhuǎn)運(yùn)策略是可行的,病毒特異性結(jié)合肽與抗病毒ASONs偶聯(lián)后,可在病毒感染入胞過(guò)程中,通過(guò)其特異性地結(jié)合病毒顆粒將ASONs帶入被感染細(xì)胞及組織內(nèi),實(shí)現(xiàn)對(duì)ASONs的定向轉(zhuǎn)運(yùn),發(fā)揮抗病毒療效。本課題提出的基于病毒靶向肽修飾的ASONs靶向轉(zhuǎn)運(yùn)與以往的靶向遞送系統(tǒng)作用機(jī)制完全