基于幾丁質(zhì)酶阻斷的生物活性物質(zhì)的篩選.pdf

1、幾丁質(zhì)酶在真菌和昆蟲的生理和發(fā)育過程中起著關鍵作用,該酶本身及其酶抑制劑是獲取生物農(nóng)藥的重要途徑。
　　 論文首先分別從蠶蛹和棉鈴蟲蛹體內(nèi)提取幾丁質(zhì)粗酶,經(jīng)過硫酸銨分級沉淀和Sephadex G-150分離得到幾丁質(zhì)酶。用SDS-PAGE測得兩酶的分子量分別為88kDa、75kDa;水解膠體幾丁質(zhì)的Km值分別為22.3μmol/L、41.0μmol/L;酶反應的最適溫度分別為45℃和50℃,最適pH值均為6.0;高濃度的Mn2+

2、對兩酶均有較強的激活作用,而Cu2+、SDS對兩酶都有較強的抑制作用;兩酶對所選用的真菌均有抑制作用。
　　 以棉鈴蟲蛹幾丁質(zhì)酶作為篩選靶標,通過平板透明圈法和DNS比色法進行幾丁質(zhì)酶抑制劑的篩選,從全國各地共34份土樣中篩選出以A0901＃菌株為代表的具有幾丁質(zhì)酶抑制性的活性菌株33株。
　　 對33株活性菌株發(fā)酵液中的活性物質(zhì)成分的分離純化技術進行初步探索,比較系統(tǒng)地研究了A0901＃菌株活性物質(zhì)的分離純化。采用活性

3、追蹤的方法對其進行分離,通過乙醇沉淀、Sevage試劑除蛋白及Sephadex G-100凝膠色譜得到一個純的活性物質(zhì),經(jīng)HPLC檢測顯示在保留時間15min左右為一單峰,DNS比色法驗證其抑制率為54.2％,紅外、質(zhì)譜、元素分析確定其為一個多羥基的化合物。
　　 經(jīng)形態(tài)、培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列聚類分析,將菌株A0901＃鑒定為鏈霉菌屬。并確定其發(fā)酵條件為:可溶性淀粉作為碳源,KNO3作為氮源,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至